过表达亮氨酸拉链假定肿瘤抑制基因1对胰腺癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移能力的影响

李强，张翠翠

作者单位：1枣庄市立医院消化内科，山东 枣庄277100；2枣庄矿业集团枣庄医院消化内科，山东 枣庄277100

胰腺癌是一种具有较强侵袭能力的消化道肿瘤，近年来的发病率呈显著上升趋势。据统计，胰腺癌在2030年将成为导致人类死亡率增加的主要原因。胰腺癌预后较差。据报道，胰腺癌的5年生存率约为5%，大多数病人由于发生转移而失去手术根治的机会，同时具有较高的复发率；放疗和化疗易产生细胞放疗或化疗抵抗性，从而降低肿瘤治疗效果。胰腺癌的发生发展过程中受到多种基因多阶段精细调控，其发病机制尚不能完全明确。近年来，分子靶向具有特异性高、副作用小等特点成为肿瘤临床治疗研究的重点和热点。研究发现，亮氨酸拉链假定肿瘤抑制基因1（leucinezipper putative tumor suppressor1，LZTS1）在多种肿瘤组织中表达量缺失，抑制肿瘤的发生发展。在胰腺癌中，研究结果显示LZTS1的表达量显著降低，但其在胰腺癌中的具体作用机制尚不清楚。因此，本研究从2018年5—12月开展实验，探讨过表达LZTS1对胰腺癌PANC-1生物学特性的影响，旨在为临床分子靶向治疗胰腺癌提供实验依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要材料

人胰腺癌PANC-1细胞购自北纳生物有限公司，胎牛血清、Lipofectamine 2000、DMEM培养基、Trizol试剂购自美国Sigma公司，细胞凋亡试剂盒、噻唑蓝（MTT）购自北京索莱宝公司；pcDNA3.0 LZTS1-1、pcDNA 3.0 LZTS1-2以及阴性对照购自广州锐博有限公司，Matrigel胶购自美国BD公司，Transwell小室购自美国Coring公司，兔抗LZTS1抗体、兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体购自美国Abcam公司。酶标仪、流式细胞仪购自美国Thermo公司。

1.2 实验方法

1.2.1

细胞的培养PANC-1细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基，显微镜观察到细胞密度约80%～90%，加入胰酶消化、传代。

1.2.2

细胞的转染取对数期PANC-1细胞，按随机数字表法分为四组，即对照组（常规培养）、NC组（转染阴性对照）、pcDNA-LZTS1-1组（转染pcDNA 3.0 LZTS1-1质粒）、pcDNA-LZTS1-2组（转染pcDNA 3.0 LZTS1-2质粒）。转染前24 h，胰酶消化、计数，收集5×10个PANC-1细胞接种至6孔板。根据Lipofectamine 2000说明书指示，分别稀释Lipofectamine 2000和质粒，将两稀释液晃动混匀，吸取100 μL加入每孔细胞，37℃培养4～6 h，更换为完全培养基。

1.2.3

蛋白质印迹法（Western blotting）收集转染后的PANC-1细胞，加入细胞裂解液提取总蛋白。将所提取的总蛋白与适量上样缓冲液混匀，沸水变性10 min；提前配置8%～10%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。将电泳的目的条带转移至聚偏二氟乙烯膜；转膜完，置于5%脱脂奶粉溶液封闭2 h；加入一抗，LZTS1 1∶5 000，GAPDH 1∶10 000，4℃孵育过夜，洗膜缓冲液漂洗3次×10 min，加入二抗，37℃孵育2 h，洗膜缓冲液漂洗3次×10 min，暗室中加入化学发光工作液孵育5 min，曝光、拍照，分析LZTS1蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值。

1.2.4

MTT法吸取5×10个各组PANC-1细胞接种至96孔板上，置于细胞培养箱中培养，分别在细胞培养24 h、48 h、72 h时，加入10 μL MTT溶液（0.5% MTT），37℃孵育4 h，加入100 μL二甲基亚砜，酶标仪中检测570 nm PANC-1细胞吸光度。

1.2.5

流式细胞术实验根据凋亡检测试剂盒的说明书，将对数期PANC-1细胞密度调整为1×10个/毫升，加入10 μL膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）和5 μL碘化丙啶（PI），避光孵育10～15 min，上机检测。

1.2.6

Transwell实验将适量Matrigel胶与300 μL无血清培养基混匀；侵袭实验前，吸取100 μL Matrigel胶稀释液加入Transwell上室膜，37℃孵育5 h，但迁移实验Transwell上室膜不添加Matrigel胶，其实验方法同侵袭实验。收集各组5×10个PANC-1细胞加入上室，500 μL含10%胎牛血清的培养基加入Transwell下室，37℃孵育24 h；磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）清洗上室，擦去残留PANC-1细胞，拍照、计数。

2 结果

2.1 转染pcDNA

-

LZTS1对LZTS1表达量的影响

PANC-1细 胞 中 转 染pcDNA 3.0 LZTS1-1和pcDNA 3.0 LZTS1-2质粒，蛋白质印迹法检测转染效果。结果如图1所示，四组LZTS1的表达量比较差异有统计学意义（

F

=107.509，

P

＜0.05）。与对照组（1.000±0.085）相比，NC组PANC-1细胞中LZTS1的表达量（1.025±0.107）未发生显著变化（

P=

0.591）；pcDNA-LZTS1-1组（2.835±0.301）和pcDNA-LZTS1-2组（4.125±0.385）细胞中LZTS1的表达量较对照组明显增加（均

P

＜0.001）；其中pcDNA-LZTS1-2对细胞中LZTS1表达量的促进作用高于pcDNA-LZTS1-1，因此后续选用pcDNA-LZTS1-2作为实验对象。

图1 转染pcDNA-LZTS1对人胰腺癌PANC-1细胞亮氨酸拉链假定肿瘤抑制基因1（LZTS1）表达量的影响

2.2 过表达LZTS1对PANC

-

1细胞增殖的影响

MTT法检测过表达LZTS1对PANC-1细胞增殖的影响，结果如表1所示，与对照组相比，NC组PANC-1细胞增殖未发生明显变化（均

P

＞0.05）；pcDNA-LZTS1-2组细胞增殖较对照组明显降低（均

P

＜0.05）。

表1 过表达亮氨酸拉链假定肿瘤抑制基因1（LZTS1）对人胰腺癌PANC-1细胞增殖的影响/±s

2.3 过表达LZTS1对PANC

-

1细胞凋亡的影响

流式细胞术检测过表达LZTS1对PANC-1细胞凋亡的影响，结果显示，三组细胞凋亡率比较差异有统计学意义（

F

=143.933，

P

＜0.05）。与对照组（6.589±0.645）%相比，NC组PANC-1细胞凋亡率（7.352±0.698）%无明显变化（

P

＞0.05），pcDNA-LZTS1-2组（23.252±2.152）%明显增加（

P

＜0.05）。

2.4 过表达LZTS1对PANC

-

1细胞迁移的影响

Transwell法实验检测过表达LZTS1对PANC-1细胞迁移的影响，结果显示，三组迁移细胞数比较差异有 统计学 意义（

F

=30.167，

P

＜0.05）。与对照 组（233.258±25.148）个 相 比，NC组 迁 移 细 胞 数（252.321±26.241）个无明显变化（

P

＞0.05），pcDNALZTS1-2组（120.145±14.210）个 降 低（

P

＜0.05）。见图2。

2.5 过表达LZTS1对PANC

-

1细胞侵袭的影响

Transwell法实验检测过表达LZTS1对PANC-1细胞侵袭的影响，结果显示，三组侵袭细胞数比较差异有 统计学 意义（

F

=35.735，

P

＜0.05）。与对照 组（117.258±12.152）个 相 比，NC组 侵 袭 细 胞 数（121.362±12.025）个无明显变化（

P

＞0.05），pcDNALZTS1-2组（56.369±6.432）个 降 低（

P

＜0.05）。见图2。

图2 过表达亮氨酸拉链假定肿瘤抑制基因1（LZTS1）对人胰腺癌PANC-1细胞迁移和侵袭的影响（结晶紫染色×200）

3 讨论

胰腺癌是一种严重危害人类身体健康的恶性肿瘤，给病人、社会带来了严重的经济负担。近年来，随着生物领域的不断发展，胰腺癌的临床治疗具有了显著的发展，探究新的基因标志物有助于肿瘤演进机制的阐释，还可以为胰腺癌的早期诊断、分子靶向治疗提供潜在位点。LZTS1是近年来发现的新型抑癌基因，在正常组织中表达，但在多种肿瘤组织中表达量显著降低，抑制肿瘤的发生发展过程。与邻近正常结肠组织相比，LZTS1在结肠癌中表达量降低，且其表达量与病人的预后生存率相关；过表达LZTS1抑制结直肠癌细胞的增殖，敲低LZTS1促进细胞的增殖，在结直肠癌的肿瘤生长过程中发挥抑制作用，可作为结直肠癌病人的潜在预后指标。免疫组化检测LZTS1在乳腺癌组织中的表达量，结果显示，LZTS1表达量较对照显著下降，与淋巴结转移相关，表明LZTS1可能参与乳腺癌转移过程。另外，LZTS1在甲状腺癌、肝癌、乳腺癌等表达量均异常，提示LZTS1在多种肿瘤生长过程中发挥重要的作用。

当机体发生病理变化时，组织中的细胞增殖与凋亡动态平衡被打破，从而影响机体的组织功能，诱导疾病的产生。在肿瘤的发生发展过程中，细胞侵袭、迁移能力的提高可促进肿瘤组织的进一步转移，严重影响病人的预后，提高复发率。为探究LZTS1在胰腺癌发生发展中的具体作用，本实验通过在胰腺癌PANC-1细胞中转入过表达LZTS1的质粒pcDNA 3.0 LZTS1-1或pcDNA 3.0 LZTS1-2（携带不同的寡核苷酸序列），结果发现，pcDNA 3.0 LZTS1-2质粒较pcDNA 3.0 LZTS1-1质粒具有较好的促进LZTS1表达的效果，因此后续实验选取pcDNA 3.0 LZTS1-2质粒作为实验对象。MTT法和流式细胞术实验观察过表达LZTS1表达量对细胞增殖、凋亡的影响，结果显示，过表达LZTS1显著抑制胰腺癌PANC-1细胞增殖，促进凋亡；进一步通过Transwell检测发现，过表达LZTS1显著抑制胰腺癌PANC-1细胞侵袭、迁移，表明LZTS1通过抑制胰腺癌细胞的增殖、侵袭、迁移等恶性生物学特性，诱导肿瘤细胞凋亡，从而阻碍胰腺癌的发生发展，与结直肠癌、乳腺癌等结果相似，均发挥抑癌作用。研究发现，LZTS1可通过调控Akt-mTOR、PI3K/Akt等信号通路抑制肿瘤细胞增殖，进 一 步 提 示LZTS1在胰腺癌中也可能通过调控细胞增殖相关的信号通路，从而参与肿瘤的发生发展，但其具体的作用机制尚需进一步的研究。

综上所述，过表达LZTS1显著抑制胰腺癌PANC-1细胞增殖、迁移、侵袭能力，促进其凋亡，在胰腺癌肿瘤发生发展过程中发挥抑制作用，为胰腺癌的临床治疗提供潜在的基因标志物，但本研究只在细胞水平研究了LZTS1的肿瘤抑制作用，未来会深入研究LZTS1发挥肿瘤抑制作用的具体分子机制以及与相关信号通路的作用，并在多株胰腺癌细胞以及动物模型中开展LZTS1的相关研究。