长链非编码RNA组蛋白去乙酰化酶3通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路调控肝癌细胞增殖、迁移侵袭和凋亡

陈斌，王猛，张囡囡

作者单位：1枣庄矿业集团中心医院肝病科，山东 枣庄277000；2枣庄市市中区人民医院感染性疾病科，山东 枣庄277000

肝癌是世界上常见的一种恶性肿瘤，其发病率居所有癌症第五位，致死率居所有癌症第二位。由于肝癌的发病隐匿，一旦确诊已至晚期，并且极易发生转移，以致其致死率极高。因此，研发有效的治疗药物对肝癌病人具有重要意义。组蛋白去乙酰化酶3（histone deacetylase 3，HDAC3）具有抑制组蛋白发生乙酰化和基因转录的作用，其在肿瘤中过度表达导致抑癌基因表达下调，以促进肿瘤的发展。组蛋白去乙酰化酶3在很多肿瘤中均表现出表达异常升高，其中包括肝癌，令人遗憾的是其在肝癌细胞的细胞表型变化中的作用尚未十分清楚。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一种高度保守且广泛表达于哺乳动物中的丝/苏氨酸蛋白激酶，归属于磷脂酰肌醇3-激酶相关激酶（phosphatidylinositol 3-kinase related kinase，PIKK）家族。mTOR信号通路抑制剂在癌症的临床治疗中已得到普遍应用，但是该通路是否参与HDAC3在肝癌中的功能机制尚未完全清楚。本研究于2018年9月至2019年5月拟以肝癌细胞SK-Hep1为研究对象，检测其中HDAC3的表达，观察敲减HDAC3、激活mTOR信号通路对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响，以期揭示其机制可能与敲减HDAC3抑制mTOR信号通路活性相关，为肝癌的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

正常肝细胞细胞系CVCL_SA11 MIHA、肝细胞癌细胞细胞系CVCL_0525 SK-Hep1均购自美国菌种保藏中心（ATCC）；DMEM购自Hyclone公司；胎牛血清购自杭州四季青；CCK-8试剂盒购自美国sellect公司；Lipofectamine2000、RNA抽提试剂盒、逆转录试剂盒购自日本TaKaRa公司；mTOR信号通路抑制剂MHY1485购自美国AbMole公司；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜购自德国罗氏公司；ECL发光液购自北京雷根生物公司；RIPA蛋白裂解液均购自碧云天公司；Transwell小室购自美国Corning公司。

1.2 方法

1.2.1

细胞培养将SK-Hep1细胞和MIHA细胞用DMEM培养基（含10%胎牛血清）在5%二氧化碳，37℃细胞培养箱中正常培养，每2～3天传代1次。

1.2.2

细胞转染与分组把正常培养的对数期肝细胞癌细胞SK-Hep1和肝正常细胞MIHA标记为SK-Hep1组、MIHA组；使用脂质体试剂盒Lipofectamine2000将si-NC、si-HDAC3（购自上海吉玛公司）、si-HDAC3+DMSO、si-HDAC3+MHY1485转染至SK-Hep1细胞，48 h后，实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测转染效率（按照“1.2.3”的方法操作，检测各组细胞中HDAC3的表达水平，以检测转染是否成功）。

1.2.3

qRT-PCR法检测细胞 中HDAC3的mRNA表达收集si-NC组、si-HDAC3组、si-HDAC3+DMSO组、si-HDAC3+MHY1485组细胞，提取RNA，逆转录为互补DNA（cDNA）。qRT-PCR检测试剂盒检测各个样本中HDAC3 mRNA的含量。计算方法，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，2法计算HDAC3的相对表达。引物信息（5'-3'）：HDAC3，正向引物GCTGCTGGACATATGAGAC，反向引物TGCCTCTGGCCTGCTATA；GAPDH，正 向 引 物GCACCGTCAAGGCTGAGAAC，反向引物ATGGTGGTGAAGACGCCAGT。

1.2.4

CCK-8法检测细胞增殖取对数生长期的

si-NC组、si-HDAC3组、si-HDAC3+DMSO组、si-HDAC3+MHY1485组细胞，将其调整为10个/毫升，取100 μL加入到96孔板，培养24 h。然后加入20 μL的CCK-8溶液，在490 nm波长下检测吸光度。吸光度与细胞增殖能力成正比。

1.2.5

Transwell小室检测细胞迁移侵袭为了检测si-NC组、si-HDAC3组、si-HDAC3+DMSO组、si-HDAC3+MHY1485组细胞的迁移和侵袭能力，使用未铺基质胶、铺有基质胶的Transwell小室分别检测细胞迁移、侵袭能力，二者的操作步骤相同。具体操作方法如下：将细胞先用无血清培养基培养24 h，调整细胞至10个/毫升，取200 μL均匀缓慢注入上室聚碳酸酯膜，600 μL含血清培养基加入下室，培养箱培养24 h。擦下上室聚碳酸酯膜表面细胞。甲醇固定，结晶紫染色。最后，用湿棉签擦去膜上表面剩余的细胞，再用镊子轻轻取下聚碳酸酯膜，使其下表面朝上，进行载玻片封片。用显微镜400倍观察细胞的数量，随机选取5个视野，拍照计数，取平均值。

1.2.6

膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin VFITC）/碘化丙啶（PI）双染检测细胞凋亡收集si-NC组、si-HDAC3组、si-HDAC3+DMSO组、si-HDAC3+MHY1485组细胞，用200 μL结合缓冲液悬浮。先加入5 μL的Annexin V-FITC，避光孵育15 min，然后加入5 μL的PI，结束染色后，立即上机，检测分析凋亡情况。细胞的凋亡率（%）=早期凋亡率+晚期凋亡率。每个样品重复3次，实验重复3次。

1.2.7

蛋白质印迹法（Western blotting）检测细胞中Akt激酶、4E-BP1、p-S6K1、S6K1蛋白表达收集si-NC组、si-HDAC3组、si-HDAC3+DMSO组、si-HDAC3+MHY1485组细胞，用RIPA裂解液裂解，BAC法进行定量，100℃水浴变性，12 000 r/min离心10 min，取上清。然后将准备好的浓缩胶、分离胶小心拔出梳子，取50 μL进行上样，电泳后，将蛋白转至PVDF膜上。转膜过程需要注意的是整个仪器和环境需要保持0～4℃的低温状态。转膜结束后，用

2.5

%的脱脂奶粉进行封闭，洗膜。将膜浸入500～1 500倍稀释的各个一抗反应液中孵育过夜。次日，先进性洗膜，然后将膜转移至稀释过的二抗反应液中4℃孵育2 h，洗膜。最后，进行显影、定影和曝光，整个过程需在暗室中进行。用Image J分析条带的灰度值，以目的条带灰度值与GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白的表达。

2 结果

2.1 HDAC3在肝癌细胞中的表达

与MIHA组比较，SK-Hep1组细胞中HDAC3的表达异常升高［（1.00±0.06）比（4.38±0.34），

t

=29.370，

P

＜0.001］。可见，HDAC3在肝癌细胞中高表达。

2.2 敲减HDAC3的肝癌细胞

与si-NC组比较，si-HDAC3组SK-Hep1细胞 中HDAC3 mRNA的 表达异常降低［（0.32±0.03）比（1.01±0.07），

t

=27.180，

P

＜0.001］。提示，成功构建敲减HDAC3的肝癌细胞。

2.3 敲减HDAC3对肝癌细胞增殖、迁移侵袭和凋亡的影响

结果如表1所示，与si-NC组比较，si-HDAC3组SK-Hep1细胞在48、72h细胞活性显著降低，迁移细胞数和侵袭细胞数均显著降低，细胞凋亡率显著升高（

P

＜0.05）。

表1 敲减组蛋白去乙酰化酶3（HDAC3）对肝癌细胞增殖、迁移侵袭和凋亡的影响/±s

2.4 敲减HDAC3对肝癌细胞中mTOR信号通路活性的影响

结果如图1和表2所示，与si-NC组比较，si-HDAC3组SK-Hep1细胞中Akt激酶、4E-BP1、p-S6K1蛋白表达均显著降低（

P

＜0.001），S6K1蛋白表达差异无统计学意义（

P

＞0.05）。

表2 敲减组蛋白去乙酰化酶3（HDAC3）的肝癌细胞哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路相关蛋白的表达/±s

图1 敲减组蛋白去乙酰化酶3（HDAC3）的肝癌细胞哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路相关蛋白的表达

2.5 激活mTOR信号通路对敲减HDAC3抑制肝癌细胞增殖、迁移侵袭和促进凋亡的影响

结果如表3所示，与si-HDAC3+DMSO组相比，si-HDAC3+MHY1485组SK-Hep1细胞中HDAC3表达显著升高，在48、72 h细胞活性显著升高，迁移细胞数和侵袭细胞数均显著升高，细胞凋亡率显著降低（

P

表3 激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路对敲减组蛋白去乙酰化酶3（HDAC3）抑制肝癌细胞增殖、迁移侵袭和促进凋亡的影响/±s

＜0.05）。

3 讨论

HDAC3在细胞周期调节中起关键作用，并且其在胰腺癌、乳腺癌、淋巴瘤中均表现出失调，也包括肝细胞癌。Lu等在肝癌的研究中报道，敲除HDAC3后能够明显损害肝脏再生和肝细胞增增，过表达HDAC3与肝癌的生长和预后不良紧密相关，敲减HDAC3则可以抑制肝癌的生长。Wu等研究报道，HDAC2在肝癌病人的肿瘤组织中表达异常升高，并且其可通过激活Hedgehog信号通路加重肝癌病人的恶性化进程。由此可见，HDAC3在肝癌发生发展中的重要作用。我们运用检测了肝癌细胞中HDAC3的表达发现其异常升高，这与前人的研究结果相一致。进一步研究，我们建立敲减HDAC3的肝癌细胞，并通过CCK-8、Transwell小室、流式细胞术检测细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡发现，敲减HDAC3后，肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭均被抑制，细胞的凋亡得到促进，这揭示了HDAC3对肝癌细胞表型变化的调控作用。进一步研究发现，敲减HDAC3可抑制肝癌细胞中mTOR信号通路的活性，因此我们认为HDAC3在肝癌中的功能可能与该通路具有一定的相关性。

研究发现，mTOR信号通路在人类多种癌症发生异常。矮甘草皂苷单体13（DT-13）在体外通过激活AMP活化蛋白激酶（AMPK）并抑制m-TOR来阻断结直肠癌肿瘤生长。mTOR/p70S6K通路在卵巢癌中被激活。卡铂可迅速mTOR表达，使卵巢癌细胞阻滞在G0/G1期，并诱导细胞凋亡。过表达微小RNA-1（miR-1）可通过靶向下调原癌基因c-Met，调控Akt/mTOR信号通路来抑制前列腺癌细胞的存活和增殖。大量研究报道，mTOR信号通路在肝癌的发生、发展、诊断治疗中均具有重要的调控作用。Malakar等报道，在肝癌中抑制mTOR的活性能够逆转原癌基因MALAT1对肝癌的致癌特性。我们研究发现，敲减HDAC3能够抑制肝癌细胞中mTOR信号通路相关基因Akt、4E-BP1、p-S6K1的蛋白表达，揭示敲减HDAC3能够抑制肝癌中mTOR信号通路的活性，此结果为探索肝癌中HDAC3发挥作用的功能机制的研究提供了依据。激活mTOR信号通路能够部分逆转敲减HDAC3的抑制肝癌细胞的细胞表型恶性化发展的作用。不仅敲减HDAC3能够抑制mTOR信号通路的活性，激活mTOR信号通路也能够逆向调控HDAC3的表达和功能。这为HDAC3在肝癌的诊断、基因治疗和靶向治疗中的应用提供了依据。

基于本研究结果，认为长链非编码RNA HDAC3抑制肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭，促进凋亡，其机制与可能失活mTOR信号通路相关。