饥饿诱导p53缺失猪成纤维细胞自噬促进凋亡*

熊 喆，邹 迪，施德佳，杨鑫娇,4，卿玉波，魏红江,5，赵红业

(1.云南省动物基因编辑与体细胞克隆技术重点实验室，云南 昆明 650201；2.云南农业大学 植物保护学院，云南 昆明 650201；3.云南省异种器官移植工程研究中心，云南 昆明 650201；4.大理大学 药学与化学学院，云南 大理 671000；5.云南农业大学 动物医学院，云南 昆明 650201)

p53基因作为一个重要的抑癌基因，可通过诱导细胞周期阻滞、细胞凋亡及自噬等途径，对肿瘤细胞增殖及发生发展过程发挥重要的调控作用[1]。有研究报道：p53调节细胞自噬水平的途径主要决定于其亚细胞定位，细胞质p53可对细胞自噬发挥负性调节作用进而抑制细胞自噬的发生[2]，细胞核p53基因可作为转录因子激活mTOR 上游的一些调节因子上调细胞自噬水平[3]。p53参与调控细胞自噬的途径主要涉及损伤调节自噬因子和激活AMPK 通路，或抑制哺乳动物雷帕霉素(mTOR)途径的靶点，或通过激活AMP 反应蛋白酶(AMPK)途径诱导细胞自噬[4]。当细胞处于应激状态下，p53可激活BAX、BNIP3 和PUMA 等因子解除Bcl-2/Bcl-xL 和Beclin1 之间的抑制作用，进而可上调细胞自噬水平[5]；正常状态下，p53基因可通过诱导细胞周期阻滞和凋亡等途径抑制细胞增殖和促进分化[6]，诱导细胞自身修复机制的激活以及导致细胞死亡，保护细胞免受由DNA 损伤引起的基因突变[7]。

自噬是一种将细胞成分传递给溶酶体进行降解回收的途径，是一种进化保守的机制，能够降解细胞中包括各种细胞器、蛋白质和入侵微生物等不同成分[8]。在调控细胞能量代谢[9]、肿瘤发生[10]、细胞生长及死亡[11]等生理过程中发挥着重要的作用。自噬体的形成依赖于一系列从酵母到哺乳动物高度保守的自噬相关基因(ATG)[12]。哺乳动物中的ATG9A 是ATG9 酵母同源蛋白，是ATG 核心蛋白中唯一的多跨膜蛋白，对自噬体的运输起着重要的作用[13]。ATG9A 主要定位于反式高尔基体网络和核内体系统，通过囊泡运输并在高尔基体和核内体系统之间循环[14]。在外界营养丰富的条件下，ATG9A 主要位于核周区及部分早期和循环核内体，氨基酸饥饿时，ATG9A核周减少，伴随囊泡群体的增加而增加，这与自噬小体标记物的部分共定位相一致[15]。

凋亡是维持机体组织功能和体内平衡的程序性细胞死亡的过程[16]，凋亡的发生对肿瘤细胞的增殖及癌症的发生调控起着重要的作用[17]。凋亡细胞主要表现为形态收缩、染色质浓缩、膜泡化和可见凋亡小体形成[18]。在细胞凋亡发生的过程中，含有死细胞内容物的凋亡小体可被周围细胞吞噬[16]。抗凋亡B 细胞淋巴瘤2 家族成员(Bcl-2、MCL1、Bcl-xL、Bcl-W 和BFL1)是调节细胞凋亡发生的关键成员，这些基因的失调不仅会损害机体的正常发育，还会导致肿瘤发生和对各种抗癌疗法的抵抗。因此，细胞可启动相关调节机制严格控制抗凋亡Bcl-2 家族成员的表达[19]。

基于已有研究报道，p53wt和p53-/-PFCs 均可在EBSS 饥饿诱导处理下发生自噬[20]。本研究进一步观察饥饿诱导、Baf A1 处理和自噬阻断2 h后p53wt和p53-/-PFCs 的细胞形态学差异，检测不同处理组的细胞凋亡水平、增殖及Bcl-2 和ATG9A 蛋白的表达差异，为进一步阐明p53基因与自噬和凋亡相关的分子调控机制奠定重要的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

野生型猪成纤维细胞(p53wtPFCs)和p53基因敲除猪成纤维细胞(p53-/-PFCs)均由云南省动物基因编辑与体细胞克隆技术重点实验室构建[21]。

1.2 方法

1.2.1 细胞系培养

细胞培养于含10%胎牛血清(FBS，Ausbian)和1.0%青—链霉素溶液(PS，BI)的DMEM培养基中，置于38 ℃、5% CO2的培养箱中进行传代培养，隔天换液，直至细胞生长汇合度为50%～60%时进行相应处理。

1.2.2 细胞形态学观察

p53wt和p53-/-PFCs 分别利用EBSS (Earle’s平衡盐溶液，Thermo Fisher Scientific)、Baf A1(巴弗洛霉素A1，上海生工)和EBSS+Baf A1 处理2 h 后，分别置于显微镜(ZEISS，型号AXIO)下，在5×、10×和20×物镜下观察细胞形态并拍照，比较并分析不同处理下细胞形态变化情况。

1.2.3 细胞增殖检测

分别取对数生长期的p53wt和p53-/-PFCs 消化沉淀进行准确计数，经含10% FBS 和1.0%PS 的DMEM 完全培养液稀释后，按2 000 个细胞/孔的密度接种于96 孔板，设空白对照(空白培养基，无细胞)、细胞对照(未经EBSS、Baf A1 或EBSS+Baf A1 处理)和处理组，置于38 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h 后，处理组分别利用EBSS、Baf A1 和EBSS+Baf A1 处理2 h，每个处理3 个重复。参照CCK-8 细胞增殖检测试剂盒说明书(全式金，Code#FC101-02)进行后续相关试验，通过全波长酶标仪(Thermo Fisher，型号1510)测定450 nm 处的OD 值，计算出各处理组细胞的增殖率。

增殖变化率(A)=(OD处理-OD对照)/(OD对照-OD空白)×100%。

1.2.4 细胞凋亡检测

p53wt和p53-/-PFCs 分别利用EBSS、Baf A1和EBSS+Baf A1 各处理2 h 后，参照细胞凋亡试剂盒检测说明书(四正柏生物，FXP018)，经磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗2 次，用0.25% Trysin-EDTA 消化，加入原细胞培养液终止消化，轻轻吹打数次后转移至15 mL 离心管内，1 000 r/min离心5 min 收集细胞沉淀，弃上清，加入1 mL预冷PBS 重悬细胞，再次离心沉淀细胞，弃上清，细胞沉淀用PBS 重悬计数。各处理组取5×104个细胞，1 000 r/min 离心5 min，弃上清，加入500 μL 1×结合缓冲液(用去离子水按体积比1∶3 稀释)轻轻重悬后，先加入5 μL AnnexinVFITC 室温孵育10 min，再加入10 μL 碘化丙啶(PI)混匀，随即进行流式细胞仪(Beckman Coulter，型号BC11093)上机检测。

1.2.5 Western-blot 检测

利用Western-blot 检测EBSS 饥饿诱导2 h 后的p53wt和p53-/-PFCs ATG9A 及Bcl-2 蛋白的表达差异。参照已有研究[22]报道分别提取细胞总蛋白并进行蛋白免疫印迹试验。p53wt和p53-/-PFCs 分别利用EBSS、Baf A1 和EBSS+Baf A1各处理2 h 后，经PBS 洗2 次后用细胞刷刮下离心收集细胞，参照试剂盒说明书(RIPA Lysis Buffer，中国)完全裂解细胞后获得细胞总蛋白，利用BCA 法(BCA 蛋白浓度测定试剂盒，碧云天，中国)测定细胞总蛋白浓度。蛋白样品(总蛋白20 μg)通过12.0%十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再转移至聚偏二氟乙烯膜上。在5%牛血清白蛋白(BSA)缓冲液中孵育60 min，与用抗体稀释液(Beyotime，中国)稀释的一抗4 ℃孵育过夜，一抗稀释倍数分别为Bcl-2 (Affinity，美国)1 000 倍、ATG9A (Abcam，英国) 5 000 倍和β-actin (Sigma，美国) 3 000 倍；之后，再与5 000 倍稀释的二抗(R &D，美国)室温孵育90 min，再在PBST 中洗涤3 次，10 min/次，通过ECL (Easysee，TRANS，中国)孵育3 min后，在化学发光成像系统(BioRad，Hercules，美国)中进行蛋白表达量显影。

1.2.6 统计学分析

2 结果与分析

2.1 饥饿诱导对p53wt 和p53-/- PFCs 形态的影响

由图1 可知：与对照相比，p53wt和p53-/-PFCs细胞经饥饿诱导(EBSS)和自噬阻断(EBSS+Baf A1)处理后，细胞膜表面均出现皱缩，形成若干波动式的褶皱和较长的突起，长出丝状伪足，而仅经Baf A1 处理后并未出现上述的细胞形态变化；经饥饿诱导和自噬阻断处理的p53-/-PFCs形态变化率均极显著低于p53wtPFCs (63.3% vs 89.4%，46.2% vs 73.8%，P＜0.01)。说明饥饿诱导促进PFCs 形态变化，p53基因敲除抑制PFCs形态变化。

图1 p53wt 和p53-/-PFCs 饥饿诱导后细胞形态变化)Fig.1 The morphological changes of p53wt and p53-/- PFCs after starvation induction

2.2 饥饿诱导对p53wt 和p53-/- PFCs 中ATG9A蛋白表达水平的影响

由图2 可知：在p53-/-PFCs 中，与对照组相比，饥饿诱导(EBSS)后ATG9A 蛋白表达水平极显著上调(P＜0.01)，Baf A1 处理后ATG9A 蛋白表达水平无显著变化(P＞0.05)，自噬阻断(EBSS+Baf A1)后ATG9A 蛋白表达水平显著上调(P＜0.05)；在p53wtPFCs 中，与对照组相比，饥饿诱导及自噬阻断后ATG9A 蛋白表达水平均无显著变化(P＞0.05)。在对照组中，与p53wtPFCs 相比，p53-/-PFCs 中ATG9A 蛋白表达水平显著上调(P＜0.05)。进一步通过饥饿诱导和自噬阻断后，与p53wtPFCs 相比，p53-/-PFCs 中ATG9A蛋白表达水平极显著上调(P＜0.01)。说明p53基因敲除能显著上调饥饿诱导PFCs 自噬相关蛋白ATG9A 蛋白表达水平，且自噬阻断后上调了ATG9A 蛋白的表达水平。

图2 p53wt 和p53-/- PFCs 经饥饿诱导、Baf A1 和自噬阻断后ATG9A 蛋白表达水平)Fig.2 The ATG9A protein expression level in p53wt and p53-/- PFCs treated with with EBSS,Baf A1 and EBSS+Baf A1

2.3 饥饿诱导对p53wt 和p53-/- PFCs 增殖的影响

由表1 可知：饥饿诱导(EBSS)、Baf A1 和自噬阻断(EBSS+Baf A1)后，p53-/-PFCs 和p53wtPFCs 的增殖率均下降。在细胞对照组中，p53-/-PFCs 的增殖速度显著快于p53wtPFCs (P＜0.05)。说明自噬降低了p53-/-PFCs 的增殖，但p53基因敲除促进PFCs 增殖。

表1 不同处理下p53wt 和p53-/- PFCs 的增殖率 Tab.1 The proliferation rate of p53wt and p53-/- PFCs under different treatment

表1 不同处理下p53wt 和p53-/- PFCs 的增殖率 Tab.1 The proliferation rate of p53wt and p53-/- PFCs under different treatment

注：空白对照. 空白培养基，无细胞；细胞对照. 未经 EBSS、Baf A1 或 EBSS+Baf A1 处理；“*”表示差异显著 (P＜0.05)。Note: control. blank medium, no cells; cell control. not processed by EBSS, Baf A1 or EBSS+Baf A1; “*” significant difference P＜0.05.

处理treatment p53wt p53-/-OD值absorbance增殖变化率/%proliferation rate of change OD值absorbance增殖变化率/%proliferation rate of change空白对照组 control 0.041±0.001 — 0.041±0.001 —细胞对照组 cell control 0.388±0.008 0.00 0.606±0.071* 0.00饥饿诱导组 EBSS 0.310±0.007 -22.49 0.368±0.047 -32.82巴弗洛霉素A1组 Baf A1 0.347±0.003 -12.01 0.434±0.038 -19.39自噬阻断组 EBSS+Baf A1 0.308±0.012 -23.16 0.341±0.042 -38.37

2.4 饥饿诱导对p53wt 和p53-/- PFCs 凋亡水平的影响

由图3 可知：在p53-/-PFCs 中，与对照组相比，饥饿处理(EBSS)后显著上调了细胞凋亡水平(P＜0.05)，自噬阻断后(EBSS+Baf A1)细胞凋亡水平无显著变化(P＞0.05)；在p53wtPFCs 中，与对照组相比，饥饿处理及自噬阻断后细胞凋亡水平无显著变化(P＞0.05)。说明p53基因缺失时，饥饿处理促进PFCs 凋亡，自噬阻断后凋亡无显著变化。

图3 p53wt 和p53-/- PFCs 饥饿诱导后细胞凋亡检测结果)Fig.3 The apoptosis analysis of p53wt and p53-/- PFCs after starvation induction

2.5 饥饿诱导对p53wt 和p53-/- PFCs Bcl-2 蛋白表达水平的影响

由图4 可知：在p53-/-PFCs 中，与对照组相比，饥饿诱导(EBSS)和自噬阻断(EBSS+Baf A1)后Bcl-2 蛋白表达无显著变化(P＞0.05)；在p53wtPFCs 中，与对照组相比，经饥饿诱导及自噬阻断后，Bcl-2 蛋白表达水平均显著上调(P＜0.05)。此外，对照组中，与p53wtPFCs 相比，p53-/-PFCs 的Bcl-2 蛋白表达水平显著下调(P＜0.05)；进一步通过饥饿诱导及自噬阻断2 h 后，与p53wtPFCs 相比，p53-/-PFCs 中Bcl-2 蛋白的表达水平极显著下调(P＜0.01)。说明p53基因缺失能显著下调饥饿诱导的PFCs 自噬相关蛋白Bcl-2 的表达水平。

图4 p53wt 和p53-/-猪成纤维细胞经饥饿诱导、Baf A1 和自噬阻断后Bcl-2 蛋白表达水平)Fig.4 The Bcl-2 protein expression level in p53wt and p53-/- PFCs treated with with EBSS,Baf A1 and EBSS+Baf A1

3 讨论

自噬体的形成是自噬发生的重要标志，ATG 蛋白在自噬发生及自噬体的形成过程中具有重要的作用[23]。在饥饿诱导过程中，ATG9 囊泡作为组成自噬体膜的基本结构单元之一，可被整合到自噬体外膜上，进一步促进自噬体的形成[24]。ATG9A 作为ATG9 的同源蛋白，在自噬体的形成和/或其初始扩张阶段中发挥重要的调控作用[25]。我们前期的研究表明：饥饿诱导2 h后，p53wtPFCs 未发生自噬，但p53-/-PFCs 发生自噬且ATG9A mRNA 表达水平显著升高[20]。本研究表明：p53基因缺失能显著上调饥饿诱导PFCs 自噬相关蛋白ATG9A 的表达水平，提示p53基因缺失促使饥饿诱导的PFCs 自噬，其自噬与ATG9A 密切相关，这与TAKAHASHI 等[26]的研究结果一致，即饥饿条件下HeLa 细胞中免疫荧光监测ATG9A 表达显著升高。此外，经自噬阻断后，ATG9A 蛋白的表达水平上调，这可能是因为Baf A1 在抑制自噬体和溶酶体结合过程中发挥作用[27]，而在ATG9A 蛋白参与的自噬体形成过程中未发挥作用。

缺乏营养或发生应激反应时，细胞的形态通常会发生变化[28]。本研究饥饿诱导后，猪成纤维细胞在形态上发生细胞膜表面皱缩，形成若干波动式的褶皱和较长的突起，长出丝状伪足。长出的丝状伪足可能是薄的富含肌动蛋白的质膜突起，这可能为细胞探测外界环境[29]，且p53-/-PFCs 中细胞形态变化率低于p53wtPFCs。该结果提示：p53基因在饥饿条件下可通过调控细胞相关信号通路来改变细胞形态，以应对不利环境条件，从而维持细胞稳态，促进细胞生存。另外，饥饿诱导后p53wtPFCs 未发生自噬，而p53-/-PFCs发生自噬且细胞形态变化率低，提示自噬反过来可降低细胞对饥饿的敏感性。

凋亡是细胞程序性死亡的重要途径[17]。Bcl-2 家族的成员参与凋亡调节[30]，抗凋亡Bcl-2 蛋白是凋亡发生的关键调节因子，在监测细胞生长和增殖以及调节生物体的遗传程序中起着核心作用[31]。本研究结果显示：p53基因在某种程度上可通过调控细胞相关信号通路来维持细胞的生长和增殖，对维持细胞的生长和代谢功能起着重要的作用，且在p53-/-PFCs 中，饥饿诱导时凋亡水平升高，自噬阻断后凋亡水平无变化，进一步证明自噬具有促凋亡作用，与CHEN 等[32]的研究结果一致。有研究表明：血清饥饿可上调Bcl-2 蛋白的表达水平[33]。在本研究中，饥饿诱导p53wtPFCs 发生饥饿应答，Bcl-2 蛋白表达水平显著上调；而在p53-/-PFCs 中，Bcl-2 蛋白表达水平无显著变化。这进一步提示p53基因在细胞凋亡拮抗蛋白Bcl-2 表达调控过程中发挥着重要的作用，其具体的分子机制还需进一步研究。

4 结论

饥饿诱导下p53-/-PFCs 的细胞形态发生显著变化，增殖率降低，ATG9A 蛋白表达水平升高，Bcl-2 蛋白表达水平无变化，且自噬发生时凋亡水平上调。其机制可能是饥饿诱导的p53-/-PFCs 自噬促进凋亡，这为进一步研究p53基因与自噬相关蛋白的表达调控及肿瘤发生发展的分子机制奠定了重要的理论基础。