陕西省布鲁氏菌菌株多位点序列分析研究

聂守民，罗波艳，孙养信，范锁平，常文辉，孙 杰，安翠红

布鲁氏菌病(Brucellosis)简称布病，是由布鲁氏菌属(Brucella)的细菌通过破损皮肤黏膜、吸入等方式侵入机体后引发的一种人兽共患的传染病[1]。布鲁氏菌病虽病死率不高但严重危害人民身体健康，同时严重影响畜牧业、旅游业、国际贸易的发展，还会带来食品安全隐患。陕西省为国家划定的布病一类地区，人间布鲁氏菌病发病水平常年居高不下，防控形势不容乐观[2]。

布鲁氏菌的基因组较保守，对人间布鲁氏菌病分离菌株进行遗传进化特征分析，有利于掌握各菌株之间的亲缘关系，从而制定科学有效的防控措施[3]。多位点序列分型(Multiple locus sequence typing，MLST)技术是一种以细菌的7个或以上的管家基因进行测序，通过比对核苷酸序列发现差异，达到区分细菌型别的目的[4-7]。MLST作为一种分子分型方法，其可操作性高，分辨能力高，实验结果可靠，便于在不同的实验室之间进行比较，从而广泛的应用于细菌型别和遗传进化特征的研究[8]。本研究通过MLST对陕西省自1958年至2020年分离的77株布鲁氏菌菌株进行遗传进化分析，为更好的防控本省人间布鲁氏菌病提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 分离菌株信息 77株分离菌株系1958年、1973-1974年、1978年、2005年、2008年、2014-2020年分离自陕西省除汉中市外的9个地级市分别是西安市、咸阳市、榆林市、延安市、渭南市、铜川市、宝鸡市、安康市、商洛市。47株为羊种3型，10株羊种1型，7株羊种2型，10株羊种变异型，2株牛种生物型，1株猪种1型。菌株由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所鉴定和保存。

1.2 标准参考菌株信息 羊种16M、牛种544A、猪种1330S由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所惠赠，剩余13株标准参考菌株等位基因型结果来源于参考文献[9]。

1.3 实验仪器 生物安全柜，恒温培养箱，高速离心机，PCR扩增仪，水平电泳仪，凝胶成像仪，移液枪。

1.4 试剂耗材 核酸提取试剂盒；超纯水；2×PCR扩增混合液(2×TSINGKE Master Mix，北京擎科生物科技有限公司西安分公司)；琼脂糖；5×TBE电泳缓冲液；DNA染料；DNA Marker(100 bp Plus DNA Ladder Marker，全式金生物技术有限公司)；96孔PCR板；Ep管；不同规格枪头。

1.5 菌株核酸制备 37 ℃恒温培养箱内将分离菌株培养至对数生长期，生物安全柜内取10 μL菌落至装有200 μL超纯水的Ep管中混匀，盖好管盖必要时可用封口膜，放置于金属浴中，80 ℃、1 h灭活，按照核酸提取试剂盒操作说明进行核酸提取。核酸提取结束后测定浓度(A260/A280)，-20 ℃低温保存。

1.6 选择MLST位点 本研究参考文献[9]选择9个布鲁氏菌基因片段作为MLST的靶标基因：7个管家基因(gap：3-磷酸甘油醛酸脱氢酶、aroA：3-磷酸莽草酸羧乙烯基转移酶、gyrB：DNA促旋酶B亚基、glk：葡萄糖激酶、trpE：邻氨基苯甲酸合成酶、dnaK：伴侣蛋白、cobQ：钴啉胺酸合成酶)、1个基因间区(int-hyp：假设蛋白基因间区)、1个外膜蛋白基因(omp25：外膜蛋白25)。

1.7 合成引物 根据9个基因片段的序列(表1)由北京擎科生物科技有限公司西安分公司进行引物合成。

表1 MLST引物名称、序列及扩增长度

1.8 PCR扩增 扩增体系30 μL：2×PCR扩增混合液15 μL、10 μmol/L引物各1 μL、核酸模板1 μL、超纯水12 μL。扩增条件：预变性(95 ℃5 min)；变性-退火-延伸(95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环)；延伸(72 ℃ 10 min)。

1.9 扩增产物分析与测序 扩增结束后，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增是否成功。扩增出特异性条带的产物直接送北京擎科生物科技有限公司西安分公司进行双向测序，获得拼接序列。

1.10 序列比对分析 将9个布鲁氏菌基因片段的拼接序列分别与MLST的标准等位基因序列进行比对(https://pubmlst.org/organisms/brucella-spp/)，确定分离菌株的ST型。利用BioNumerics(Version7.6)软件，通过UPGMA(平均连锁聚类法)对分离菌株进行分析，用最小生成树(Minimum spanning tree)进行高级聚类分析，探讨其进化关系。

2 结 果

2.1 生物型别 共检测77株布鲁氏菌，包括羊种1型10株，羊种2型7株，羊种3型47株，羊种变异型10株，牛种生物型2株，猪种1型1株，其中羊种3型最多，占61.04%。1958-2008年，19株布鲁氏菌生物型多样，其中羊种3型仅3株，占15.79%；2014-2020年，58株布鲁氏菌中羊种3型有44株，占75.86%(表2、表3)。

表2 陕西省77株分离菌株时间分布情况

表3 陕西省77株分离菌株地区分布情况

2.2 ST比对结果 77株分离菌株比对出现3种ST型，分别为ST2、ST8、ST14。1958年和2005年各有1株牛种生物型菌株(58055、05045)结果为ST2型，1974年1株猪种1型菌株(74012)鉴定为ST14型；其余羊种菌株比对结果均为ST8型，占96.10%。2014-2020年，58株羊种布鲁氏菌均为ST8型(表2)。

表4 陕西省77株布鲁氏菌分离株MLST结果

2.3 BioNumerics分析结果 利用BioNumerics(Version7.6)软件，构建聚类图及最小生成树，77株菌形成3个分支，ST14为1支，ST2为1支，ST8为1支，不同ST型的标准株各自形成1支。最小生成树显示本研究的74株布鲁氏菌分离株(羊种1型、2型、3型、变异型)与标准株63/9(羊种2型)的ST型一致，聚为一簇，同种群布鲁氏菌亲缘关系较近，聚为一簇，说明ST型与布鲁氏菌生物种型具有一定相关性。ST型与布鲁氏菌传统分型结果稍有差异，但总体上基本一致(图1、图2)。

图1 陕西省77株布鲁氏菌分离株MLST聚类分析

图2 陕西省77株布鲁氏菌分离株MST分析

3 讨 论

陕西省属于国家划定的布鲁氏菌病一类地区，上世纪50年代曾在我省广泛流行，疫情严重地区人畜感染率达50%。20世纪80—90年代，由于加大防控力度，疫情降至历史最低水平。近年来，随着奶山羊、肉羊产业的大力发展，家畜饲养量不断增加，动物及其产品流通频繁等因素的影响，人间布鲁氏菌病的发病数量不断上升。布病不仅严重阻碍畜牧业发展，也危及到人民身体健康和公共卫生安全，我省的防控形势越来越严峻。

对布鲁氏菌分离株进行生物种型鉴定、分子分型研究、遗传进化特征分析等可以更好地了解流行菌株之间的关联，为合理有效的防控人间布鲁氏菌病提供科学依据。布鲁氏菌种型鉴定依靠的是血清凝集技术，该技术不但要求操作者要有丰富的经验还对实验生物安全有很大的要求。而多位点序列分型(Multiple locus sequence typing，MLST)就克服了以上的不足，它是一种很好地分子分型研究及遗传进化分析的技术，是以测序为技术基础，分辨能力高，结果准确可靠，重复性好[10-11]。MLST自1998年首次被提出来以后[12]，基于以上优势在病原微生物领域得到了快速发展。Adrian等[9]利用MLST技术研究了30个不同国家的160株菌发现了27个ST型，国内新疆、内蒙古等也分别利用该技术对本地区的布鲁氏菌分离株进行了研究[13-16]。本研究对了解陕西省布鲁氏菌分离株的遗传进化特征具有重要意义。

陕西省的布鲁氏菌分离株生物种型有羊种3型、羊种1型、羊种2型、羊种变异型、牛种生物型、猪种1型，羊种3型构成比为61.04%，2005-2020年羊种3型是主要流行菌株；ST型别包括ST2、ST8、ST14，ST8型构成比为96.10%，说明ST8型是我省主要的流行菌株序列型。羊种生物型分离菌株的ST型均为ST8，说明羊种生物型菌株MLST分型比较稳定。2株ST2分别于1958、2005年从绥德、横山人血中分离到，2株菌的分离时间前后相差47年，1株ST14型的猪种1型布鲁氏菌于1972年从鄠邑鹿血中分离得到，自此也未再发现。说明MLST能够很好的将不同种的布鲁氏菌进行区分，结果可靠。1958年、1973-1979年2个时间段内分离得到15株布鲁氏菌，为羊种1型6株、羊种2型7株、猪种1型1株、牛种生物型1株，未分离到羊种3型，ST型结果为ST2、ST8(86.67%)、ST14。2005-2008年、2014-2020年两个时间段内分离得到62株布鲁氏菌为羊种1型4株、羊种3型47株、羊种变异型10株、牛种生物型1株、ST型结果为ST2、ST8(占98.39%)。后两个时间段内未再出现猪种1型及羊种2型，在今后人间布病的防控工作中应予以关注。

本研究建立了陕西省布鲁氏菌MLST序列数据库，为下一步做好布鲁氏菌病的防控提供了科学依据。

利益冲突：无