细粒棘球绦虫TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

王冰洁，赵 莉，班万里，段兰利，陈云英，张壮志

囊型包虫病(CE)即细粒棘球蚴病，是由细粒棘球绦虫幼虫(棘球蚴)引起的一种慢性人兽共患病[1]。病变可使邻近器官组织萎缩及功能障碍，病变包囊一旦破裂，可引起过敏反应，甚至死亡，严重威胁了公共安全和畜牧业生产，影响社会经济发展[2]。鉴于该病的广泛流行和严重程度，世界卫生组织(WHO)将其作为17种被忽视的疾病之一纳入2020年战略路线图[3]。在我国，几乎所有省(直辖市、自治区)都有该病的报告，尤以新疆、宁夏、青海、甘肃、陕西、西藏、四川、云南、内蒙古等地区最为严重[4]。据统计，全国每年患包虫病的牛、羊在5 000万头(只)以上，造成的经济损失超过30亿元，推算患病人数为166 098例[4-5]，包虫病仍是世界范围内引起家畜发病和死亡的重要原因之一。因此及时、准确地监测囊型包虫病，对控制该病的流行、综合防控措施的实施和防治效果的评价等都具有十分重要的意义。

目前，用于囊型包虫病的检测方法主要有4类，其中影像学检测是该病检测的首选，但难以区分病变包囊和肿瘤；病原学检测是确诊该病的经典方法，但对实验人员专业知识和技术要求较高；免疫学检测在早期检测中发挥重要作用，但无法避免假阳性结果[6-7]；分子生物学检测是从基因水平对病原进行检测的方法，具有特异、敏感等优点，目前已用于包虫病特异基因筛选等方面的研究[8-9]。本研究以细粒棘球绦虫线粒体基因的特异性引物和探针建立起了用于囊型包虫病检测的荧光定量PCR方法，以便快速、准确的区分Eg，并将其应用于Eg的大规模监测。

1 材料与方法

1.1 道德申明 本研究获得了新疆畜牧科学院伦理委员会的批准(批准号20130319-07)，所有动物均按照中华人民共和国动物伦理程序和指南进行处理。

1.2 虫株及临床样本 细粒棘球蚴(cystic echinococcus)、细粒棘球绦虫(Eg)、多房棘球蚴(alveolar echinococcus)、多房棘球绦虫(Echinococcusmultilocularis，Em)、脑多头蚴(Coenuruscerebralis，Cc)、多头多头绦虫(Multicepsmulticeps，Mm)、细颈囊尾蚴(Cysticercustenuicollis，Ct)、泡状带绦虫(Taeniahydatigena，Th)及犬弓首蛔虫(Toxocaracanis，Tc)虫株均由本实验室分离保存。临床样本(牛/羊肝、肺包囊、犬肠道寄生虫体)由本实验室在伊犁昭苏县采集，样本详细信息见表1。

表1 临床样本信息

1.3 主要试剂 琼脂糖、2×SuperReal PreMix(Probe)、血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒等购自天根生化科技(北京)有限公司；2×Taq PCR MasterMix、GoldenViewTM核酸染料、DL2000 Marker、pMD19-T、Taq DNA聚合酶等购自新疆宝信生物工程有限公司。

1.4 方 法

1.4.1 引物及探针的设计与合成 针对Eg线粒体基因保守区，使用Oligo 6.0软件设计特异性引物和探针。Eg-F：5′-GCAGGTTACTTTGATATAGTAAATTGTG-3′；Eg-R：5′-CCACAATTAAAA-AAATAAATAAC-3′；Eg-P：5′-(FAM)ATACTATGGTCCATATATCTATATTAAGAGCTG-AG(TAMRA)-3′，由北京六合华大基因科技有限公司合成。

1.4.2 重组质粒标准品的制备 提取Eg阳性样本DNA并进行常规PCR扩增，扩增条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，25个循环；最后72 ℃延伸10 min，产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，回收纯化目的片段并连接至pMD19-T载体，转化大肠杆菌感受态(DH5α)，筛选阳性菌落并扩大培养，抽提质粒，进行PCR鉴定、测序及序列分析，根据序列分析结果选择正确的重组质粒作为标准品，测定重组质粒的浓度，并换算成拷贝数。

1.4.3 反应体系及条件优化 通过矩阵法筛选反应体系中引物和探针的最适浓度组合，并确定PCR反应的退火-延伸温度、反应时间及循环数。

1.4.4 标准曲线的建立及敏感性试验 10倍梯度稀释已知拷贝数的重组质粒标准品，得到109拷贝/μL～100拷贝/μL共10个稀释度的质粒模板，每个稀释度做3个复孔，建立荧光定量PCR标准曲线并确定该方法的最低检出限。

1.4.5 特异性试验 按照建立的荧光定量PCR检测方法对提取的Eg、Em、C.cerebralis、M.multiceps、C.tenuicollis、T.hydatigena及T.canis阳性样本DNA进行检测，判定该方法的特异性。

1.4.6 重复性试验 选取107～103拷贝/μL的标准品进行重复检测，比较同一浓度梯度的标准品在重复检测中的扩增曲线与Ct值之间有无统计学差异，确定该方法的稳定性。

1.4.7 临床样本的检测 应用建立的荧光定量PCR方法、常规PCR方法和病原学方法对从伊犁昭苏县采集的50份疑似感染细粒棘球蚴或细粒棘球绦虫的临床样本(表1)进行检测，比较三者的敏感性和符合率。

2 结 果

2.1 重组质粒标准品的鉴定 提取的质粒经PCR扩增，得到长度约为187 bp的目的片段(图1)，测序比对后确定为细粒棘球绦虫线粒体基因，表明标准阳性重组质粒构建成功，命名为pMD19-T-Eg，质粒浓度经测定为100 μg/mL。

M：DNA Marker(DL2000)；1：PCR products of recombinant plasmids；2：Negative control

2.2 反应体系及条件优化结果 优化后，确定最佳反应体系为(20 μL)：2×SuperReal PreMix(Probe)10 μL，上、下游引物(10 μmoL/L)各0.5 μL，探针(10 μmoL/L)0.25 μL，模板DNA 1 μL，灭菌ddH2O 7.75 μL。最佳反应条件为：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，40个循环，同时收集荧光信号。

2.3 标准曲线及敏感性试验结果 以109拷贝/μL～100拷贝/μL的重组质粒标准品为模板进行荧光定量PCR扩增，获得扩增动力学曲线(图2)和标准曲线(图3)。从图中可以看出建立的方法可以检测出的标准品最低浓度为102拷贝/μL，建立的标准曲线相关系数R2=0.998，表明建立的方法灵敏度高、误差小。

1～10：109 copies/μL～100 copies/μL；11：Negative control

图3 Eg实时荧光定量PCR的标准曲线

2.4 特异性试验结果 以Eg、Em、C.cerebralis、M.multiceps、C.tenuicollis、T.hydatigena及T.canis阳性样本DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，只有细粒棘球蚴和细粒棘球绦虫出现良好的扩增曲线(图4)，表明建立的方法特异性较好。

1：cystic echinococcus；2：Echinococcus granulosus(107 copies/μL)；3；Eg standard plasmids；4：alveolar echinococcus；5：Echinococcus multilocularis；6：Coenurus cerebralis；7：Multiceps multiceps；8：Cysticercus tenuicollis；9；Taenia hydatigena；10：Toxocara canis；11：Negative control

2.5 重复性试验结果 用107拷贝/μL～103拷贝/μL的标准品进行的组内和组间重复性试验，变异系数均小于3%(表2)，表明建立的方法重复性和稳定性较好。

表2 实时荧光定量PCR重复性试验结果

2.6 临床样品检测结果 对采集自伊犁昭苏县的50份临床样本(表1)分别用荧光定量PCR方法、常规PCR方法和病原学方法进行检测，荧光定量PCR检测的阳性率为12%(6/50)，常规PCR为8%(4/50)，病原学为12%(6/50)，三者阳性符合率为100%。

3 讨 论

我国是囊型包虫病的高度流行区，流行区面积达全国总面积的46%[10]。近年来，随着我国经济的高速发展，动物疫病防治工作面临着前所未有的挑战，快速、高通量检测技术的建立与应用是开展国家动物疫情监测、有效实施风险分析、加强动物疫病管理和进行市场监督的重要手段。荧光定量PCR作为一种快速、准确、高效的检测方法，可实现多个样品的自动化检测，检测时间较普通PCR短且污染少，已经成为实验室检测病原的主要手段之一[11]。目前荧光定量PCR方法主要包括染料法(如：SYBR Green染料)和探针法(如TaqMan和MGB探针等)，虽然染料法成本比探针法低，但探针法特异性好，在临床检测中有着突出优势[12-13]。

因此，本研究基于细粒棘球绦虫线粒体基因保守区设计了特异性引物和探针，建立了用于检测该病的荧光定量PCR方法。该方法获得的标准曲线线性关系好，在109～102拷贝/μL相关系数达0.998，灵敏度达102拷贝/μL，与其他病原(Em、C.cerebralis、M.multiceps、C.tenuicollis、T.hydatigena、T.canis)不存在交叉反应，组内和组间变异系数较小(<3%)，说明该方法灵敏度高、特异性强、重复性和稳定性好。在临床样品检测试验中，能成功地检测出Eg，且与普通PCR方法相比，检出率明显提高，检测时间明显缩短，说明本研究建立的方法可以对囊型包虫病病原进行检测，及时发现传染源，对该病的防控具有重要意义。

利益冲突：无