减压处理对荔枝果实膜脂代谢和能量代谢的影响

李泽,黄和,钟赛意,陈小丽,陈建平,任鹏康,刘海

(广东海洋大学 食品科技学院，广东省亚热带果蔬加工现代农业科技创新中心，广东 湛江，524088)

荔枝是我国盛产的名优水果，属于非呼吸跃变型果实，是最不耐贮藏的果品之一，荔枝在采摘后基本上每日一变：果皮色泽变褐、果实香味散失、果肉风味变差、直到发生霉变。新鲜采摘后的荔枝果实极容易失水，虽然荔枝果肉中的水分含量很高，但是在没有特定保湿冷冻贮藏环境下，果皮以及薄膜难以保持果肉中的水分，且果皮不断失水衰老导致通透性增大，进而引起荔枝果实的褐变和霉变[1]。苹果切开后发生褐变的原因主要是由多酚类物质引起的，而荔枝果皮中的红色素降解再加上多酚类物质的氧化催化作用，使荔枝果皮非常容易发生褐变。这种特性导致运输困难，严重制约我国荔枝产业健康和持续发展[2]。

呼吸作用是生物体重要生命活动标志，荔枝果实在采摘后同样进行着必不可少的呼吸作用，利用各种呼吸代谢相关酶将复杂有机物分解为自身能利用的简单有机物，同时释放出能量。荔枝在呼吸代谢过程中用以维持自身生命活动的能量，主要由细胞中的线粒体产生。与此同时，活性氧也会被释放出来。活性氧累积后容易破坏细胞膜的通透性，对荔枝的老化有着加速的作用[3]。

目前国内外现有的荔枝保鲜技术主要包括：熏硫技术、冷藏、涂膜处理和气调贮藏，其中熏硫技术影响果实风味且有残留问题，对人体有害；气调贮藏因使用高纯度的惰性气体，成本较高；因荔枝果皮不光滑，涂膜处理难以完全覆盖，效果不显著；冷藏保鲜效果最好，但当荔枝转入常温货架会迅速褐变，24 h即失去商品价值。

减压处理是一项新兴的物理保鲜技术，能够形成低压、低O2的贮藏环境，防止有害气体的侵入，消除田间热并抑制微生物生长繁殖，防止果实生理病害的出现[4]。研究表明，减压处理能够降低新疆白杏果实的软化速率[5]；有效提高水蜜桃的抗氧化体系[6]；可使草莓的呼吸强度减弱，减少丙二醛含量[7]。目前，国内外关于减压处理技术在荔枝果实上的研究未见报道，本实验试图通过研究不同减压处理对采后荔枝果实在常温贮藏期间细胞膜功能与膜脂代谢相关酶活性的影响，确定最佳贮藏压力处理条件，初步探讨荔枝果实能量代谢对膜完整性和功能的影响，以及果皮膜脂和能量代谢特性、膜结构和功能的变化，以揭示膜脂和能量代谢在膜劣变和果皮褐变中的作用，进一步了解荔枝果实细胞膜功能完整性对荔枝保鲜的重要性。

1 材料与方法

1.1 材料

采用的荔枝品种为‘妃子笑’，采自湛江市东坡荔枝园，采摘后马上运送至实验室，挑选出8成熟、色泽相同、大小均匀、无损伤病虫害的荔枝果实，将挑选好的荔枝果实放入抽滤瓶内，每个抽滤瓶装30颗果实，利用真空泵进行不同减压处理，压力分别设置为40、60和80 kPa，以常压(101.325 kPa)下不经任何处理的荔枝为对照，在常温(25 ℃)货架贮藏，进行取样分析，取样天数分别为0，2，4，6 d，取样后复压，每组重复3次。

1.2 实验方法

1.2.1 果皮褐变指数的测定

果皮褐变程度评估参考林河通等[8]的方法。随机选取30个荔枝果实计算褐变指数。褐变等级按0级：没有褐变；1级：轻微褐变；2 级：褐变面积<25%；3级：褐变面积在25%～50%；4 级：褐变面积>50%来区分。褐变指数计算如公式(1)所示：

(1)

1.2.2 果皮霉变指数的测定

果皮霉变率计算根据JIANG等[9]的方法。随机选取30个荔枝果实来计算霉变指数。霉变程度按0级：没有霉变；1级：轻微霉变；2级：霉变面积<25%；3级：霉变面积在25%～50%；4级：霉变面积>50%进行区分。霉变指数计算如公式(2)所示：

(2)

1.2.3 果皮细胞膜相对渗透率的测定

参考JIANG等[10]的方法。从每组中随机取出30个荔枝果皮，打成30个直径为10 mm的果皮圆片，蒸馏水洗净滤掉水分，在0.3 mol/L甘露醇中放置30 min后测第1次电导率；将其煮沸冷后开始测第2次电导率。相对渗透率用前后2次之比来表示。

1.2.4 果皮细胞线粒体的提取

参照谭才邓[11]的方法。随机从30个荔枝果实中选取10 g果皮进行液氮研磨，加入线粒体提取液[0.25 mol/L蔗糖、0.3 mol/L甘露醇、0.1%(质量分数)半胱氨酸、1 mmol/L EDTA、0.5%(质量分数)聚乙烯吡咯烷酮、0.1%(质量分数)牛血清白蛋白]的烧杯中，4 ℃静置15 min后过滤，滤液在4 ℃下再次离心，待离心停止，收集沉淀，加入洗涤液[0.25 mol/L蔗糖、1 mmol/L EDTA、0.1%(质量分数)牛血清白蛋白、0.3 mol/L甘露醇]溶解，再经过2次离心所得沉淀即为线粒体，悬浮于线粒体提取液中备用。

1.2.5 细胞膜流动性的测定

反应体系(2 nmol/L含荧光偏振探针1, 6二苯基-1, 3, 5己三烯的四氢呋喃溶液，0.3 mol/L甘露醇，0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液)，加入上述线粒体悬浮液，振荡摇匀恒温加热20 min。以不加1,6二苯基-1,3,5己三烯(DPH)溶液作对照，在荧光分光光度计发射波长为432 nm，激发波长为362 nm下，测定荧光偏振值(P值)。P值越小，则流动性越大。

1.2.6 琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase，SDH)活性的测定

参考ACKERLL等[12]和朱广廉[13]的方法测定。反应混合液2.7 mL(pH 7.4 琥珀酸钠0.2 mol/L、pH 7.4 磷酸钾缓冲液0.2 mol/L、0.9 mmol/L 2,6-二氯酚靛酚)，0.3 mL线粒体提取液；先量取适量反应混合液置于37 ℃水浴锅中，待水浴5 min后加入线粒体提取液，再加入0.3%甲硫酚嗪(5-methylphenazinium methosulfate，PMS)轻微振荡摇匀，以2,6-二氯酚靛酚钠在紫外分光光度计，600 nm处的还原速度表示SDH活性。实验重复3次。

1.2.7 细胞色素氧化酶(cytochrome oxidase，CCO)活性的测定

参照ERREDE等[14]的方法测定。反应混合液2.7 mL[pH 7.4磷酸钾缓冲液0.2 mmol/L、2%(体积分数) TritonX-100、蒸馏水]，0.3 mL线粒体提取液。先量取适量反应混合液置于37 ℃水浴锅中，待水浴2 min后加入线粒体提取液和20 mg/mL细胞色素C，以细胞色素C在紫外分光光度计，550 nm处被氧化的速度来表示CCO活性。实验重复3次。

1.2.8 ATP、ADP和AMP含量的测定

参照OZOGUL等[15]的方法提取荔枝果皮中三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)和一磷酸腺苷(adenosine monophosphate，AMP)。从30个荔枝中取10 g果皮组织进行液氮研磨，加入高氯酸提取，离心后的上清液用氢氧化钾中和至pH 6.8，冰浴中静置，过滤器过滤，在分析前存放于-20 ℃。按LIU等[16]的方法进行。采用Water e2695型高压液相色谱仪。色谱条件如下：超球体ODS EC(250 mm×4.60 mm)色谱柱，在254 nm处检测并分析峰，采用连续梯度洗脱，流动相流速为1.2 mL/min，洗脱12 min，进样体积为20 μL，以确保完全分离并计算能荷(energy charge，EC)，如公式(3)所示：

(3)

1.2.9 果皮透射电镜的观察

参照黄旭明等[17]的方法。随机选取30个荔枝果皮切成约4 mm×4 mm×1 mm的方块，用戊二醛固定，用0.1 mol/L的磷酸缓冲液(pH 7.0)漂洗样品；经过纯包埋剂包埋样品；加热固化后即得到包埋好的样品。通过LEICA-705902型超薄切片机将样品切成50 nm的切片，再经30 g/L柠檬酸铅-醋酸双氧铀溶液各染色5 min，即可在JEM-1011型透射电镜下观察并拍照。

1.3 数据分析

采用Excel整理数据、Origin 2017作图和SPSS 19.0进行差异显著性分析。上述每个实验重复3次，实验结果取平均值。

2 结果与分析

2.1 减压处理对荔枝果皮褐变指数的影响

采后荔枝果实不耐贮藏，极易发生褐变，在常温货架期间果皮褐变程度逐渐变深。果皮褐变加剧了荔枝果实的衰老程度，商品价值骤然下降[18]。由图1可知，随着贮藏时间延长，荔枝果实褐变指数呈上升趋势；在0～2 d，荔枝果皮褐变指数变化趋势不大；2 d后，荔枝果皮褐变指数变化趋势增大，其中对照组、40和80 kPa处理果实的褐变指数增大速度较快，而60 kPa处理果实的褐变指数增长较缓慢，明显低于其他处理，说明60 kPa减压处理明显延缓了果皮褐变的发生，效果最佳，与对照组相比，存在差异显著(P<0.05)。

图1 减压处理对荔枝果皮褐变指数的影响Fig.1 Effect of reduced pressure treatment on browning index of litchi pericarp

2.2 减压处理对荔枝果皮霉变指数的影响

采后荔枝果实会出现严重的霉变现象，一般是采后果实表面残留的微生物引起的，加上在高温高湿季节成熟，更有利病源微生物生长，造成对鲜果的侵染，蔓延后霉变加重[19]。如图2所示，前2 d，荔枝果实并没有发生霉变，2 d后，对照组、40和80 kPa减压处理组果实霉变指数增加较快，而60 kPa处理组果皮的霉变指数始终处于较低水平，在贮藏第6天时，对照组果皮的霉变指数是60 kPa处理组果实的3.5倍，说明与对照组和其他减压条件处理，60 kPa处理明显抑制采后荔枝果皮霉菌的生长(P<0.05)。

图2 减压处理对荔枝果皮霉变指数的影响Fig.2 Effect of reduced pressure treatment on mildew index of litchi pericarp

2.3 减压处理对荔枝果皮细胞膜相对渗透率的影响

细胞膜渗透性是分析细胞膜完整性的关键指标，它的大小能够反映果实衰老和损伤程度，一般用相对电导率表示[20]。如图3所示，在整个贮藏期间，对照组果皮中的电导率远高于减压处理组；贮藏第4天，对照组、40和80 kPa处理组的电导率均出现峰值；在常温货架期间，60 kPa处理组果皮中的细胞膜渗透率基本趋于平稳，与对照组相比，两者之间具有显著性差异(P<0.05)。

图3 减压处理对荔枝果皮细胞膜相对渗透率的影响Fig.3 Effect of reduced pressure treatment on relative permeability of litchi pericarp cell membrane

2.4 减压处理对荔枝果皮细胞膜流动性的影响

当细胞膜流动性下降，膜脂通透性增强，膜脂中饱和脂肪酸含量增加时，意味着膜脂系统劣变[21]。如图4所示，在贮藏期间，对照组果皮中细胞膜流动性P值高于减压处理组，4组果皮中细胞膜流动性P值随着常温货架期的延长而不断增长；前2 d，全部呈缓慢上升趋势；在2～6 d，开始呈直线迅速上升；到第6天，均出现峰值，且对照组荔枝果皮中细胞膜流动性P值(P<0.05)显著高于60 kPa处理组，说明减压处理能有效维持荔枝果皮细胞膜结构，其中60 kPa处理组效果较好。

图4 减压处理对荔枝果皮细胞膜流动性的影响Fig.4 Effect of reduced pressure treatment on cell membrane fluidity of litchi pericarp

2.5 减压处理对荔枝果皮中SDH活性的影响

SDH是果皮细胞线粒体内能量代谢的关键酶。如图5所示，在0～2 d时，对照组的SDH活性呈下降趋势，而减压处理组的SDH活性逐渐上升，酶活性较对照组要高，对照组的荔枝果实呼吸作用受到抑制。在2～6 d时，对照组的SDH活性有所增加，而60 kPa处理组的SDH活性趋于平稳，使线粒体的功能维持在一个较为稳定的状态，与对照组相比，差异显著(P<0.05)。

图5 减压处理对荔枝果皮中SDH活性的影响Fig.5 Effect of reduced pressure treatment on SDH activity in litchi pericarp

2.6 减压处理对荔枝果皮中CCO活性的影响

CCO活性的高低影响组织细胞的好氧速率，能反映出荔枝果实的有氧呼吸状态。由图6可知，在贮藏期间，减压处理组的CCO活性远高于对照组，在荔枝新鲜采摘后的前期0～2 d，细胞的CCO活性均呈上升趋势，此时荔枝果实的有氧呼吸代谢旺盛。第2天后开始下降，对照组的CCO酶活性迅速下降，在第4 天下降到最低后又开始上升，减压处理组CCO活性趋于平稳。在贮藏过程中，60 kPa处理组线粒体膜CCO活性显著(P<0.05)高于对照组。说明60 kPa处理下的荔枝果实能保持较为稳定的有氧呼吸水平，并对荔枝果实细胞膜脂代谢起到一定的抑制作用。

图6 减压处理对荔枝果皮中CCO活性的影响Fig.6 Effect of reduced pressure treatment on CCO activity in litchi pericarp

2.7 减压处理对荔枝果皮ATP、ADP、AMP和EC的影响

如图7-a所示，在贮藏期间，ATP 含量均有不同程度下降，在贮藏后期(4～6 d)下降较快，60 kPa处理荔枝果皮ATP 含量显著(P<0.05)高于对照处理，为对照的1.38倍。

如图7-b所示，在采收当天，减压处理荔枝果皮ADP含量略高于对照处理。在贮藏期间，ADP含量整体呈先上升后下降的趋势，在前2 d开始上升，之后快速下降，到第6天，减压处理组荔枝果皮ADP含量远高于对照组，分别是对照组的1.76、1.99和1.79倍，其中60 kPa处理荔枝果皮ATP含量显著(P<0.05)高于对照组。

如图7-c所示，在采收当天，减压处理荔枝果皮AMP含量低于对照处理。在贮藏期间，AMP含量均呈连续上升趋势，并在2～4 d有一个快速上升过程，并在第6天全部达到峰值。在整个贮藏期间，60 kPa处理组AMP含量显著(P<0.05)低于对照组。

如图7-d所示，采后荔枝果皮EC值处于逐渐下降趋势，在贮藏后期60 kPa处理组能荷显著(P<0.05)高于对照组。减压处理延缓了荔枝果皮能荷的下降。

上述结果表明，减压处理有效延缓妃子笑荔枝果皮ATP、ADP含量的下降和AMP含量的升高，抑制果皮能荷的下降，有利于荔枝果皮处于较高的能量水平。

a-ATP；b-ADP；c-AMP；d-EC图7 减压处理对荔枝果皮的影响Fig.7 Effects of reduced pressure treatment on litchi pericarp

2.8 减压处理对荔枝果皮超微结构的影响

由图8中1～2可知，新鲜荔枝果皮细胞结构完整，细胞膜与细胞壁紧贴，所有细胞器都集中在质膜上，可以看到内质网、液泡、细胞核、核糖体、线粒体等，还有其他一些细胞器，表明果皮细胞具有鲜活生命力。

由图8中3～6可知，贮藏2 d后荔枝常温货架期果皮超微结构变化。2组荔枝果皮细胞结构随着常温货架期的延长而变得模糊，基本看不到完整的细胞器。在常温货架期，60 kPa处理组的细胞膜破损程度较对照组小。2组的细胞在常温货架后期皆出现质壁分离的现象，与对照组相比较而言，60 kPa处理组的荔枝果皮细胞质壁分离较轻微。

由图8中7～10可知，贮藏4 d后荔枝常温货架期果皮超微结构变化。2组荔枝果皮细胞膜脂系统随着常温货架期的延长而变得模糊破裂，对照组在常温货架后期基本找不到细胞膜，胞内发生质壁分离，细胞器遭到降解，细胞壁变形，此时果皮细胞失去生命力；而60 kPa处理组保持一定的膜脂，细胞膜没有完全脱离细胞壁，还能看见一些细胞器。

由图8中11～14可知，贮藏6 d后荔枝常温货架期果皮超微结构变化。在贮藏6 d后，2组荔枝果皮细胞破损程度越来越大。随着常温货架期延长，对照组不但细胞膜结构完整性消失，出现胞吞现象，细胞壁也出现破裂，表明褐变后的细胞生命力丧失严重；而60 kPa处理组的荔枝果皮细胞微结构情况较好，细胞膜结构没有完全破坏。

图8 荔枝贮藏过程中果皮超微结构变化Fig.8 Ultrastructural changes of litchi pericarp during storage注：荔枝果皮透射电镜观察倍数：1-(×3 700)；2-(×2 550)；3-(×3 700)；4-(×8 900)；5-(×1 650)；6-(×6 200)；7-(×8 900)；8-(×2 550)；9-(×2 550)；10-(×12 500)；11-(×3 700)；12-(×3 700)；13-(×2 550)；14-(×1 650)

3 结论

荔枝极易发生褐变霉变并引发腐烂，贮藏性差。本试验中，以不同减压处理和常压作对照，研究了荔枝在贮藏2、4、6 d后，2组处理的荔枝果实细胞膜功能与膜脂代谢相关酶活性变化。研究表明，荔枝果皮结构特殊，采后褐变与细胞膜的完整性密切相关，细胞渗透性增大，会导致膜内酶和底物区域化破坏。在本研究中60 kPa处理通过延缓细胞膜渗透性的增加以及维持了果皮细胞膜的流动性，保持了细胞膜结构的完整性和功能，从而显著降低了荔枝果实的果皮褐变和霉变率。

线粒体中能够进行细胞组织能量代谢和物质转化，线粒体呼吸作用标志酶SDH和CCO活性的高低能直接反映出线粒体生命系统的功能状态。本研究中，在荔枝果实的成熟期，对照组和60 kPa处理组的SDH和CCO活性都比较高；而在荔枝果实的衰老期，2组活性都有所下降。表明随着贮藏时间的延长，荔枝果实细胞膜通透性增大，导致细胞膜的功能遭到破坏，可能使膜脂代谢相关酶的活性也受到抑制，使细胞加速衰老。

采收后的荔枝果实，失去了外源能量供给，需要通过分解自身营养物质来维持自身正常代谢的能量。随着采后果蔬的衰老、病原菌侵染的发生，果蔬氧化磷酸化作用明显降低，会引起ATP生成的减少及EC水平的下降，ATP短缺和EC水平低意味着维持细胞生命活动所需要的能量不足，而能量亏缺会导致整个代谢系统瓦解，使细胞膜结构遭到破坏，从而加速采后荔枝果实品质败坏。本试验中，减压处理能够使采后妃子笑荔枝果实果皮ATP、ADP含量保持在较高水平，延缓AMP含量的上升，维持较高的EC水平，保证采后果皮细胞膜修复所需要的能量供应，延缓果皮细胞膜完整性的破坏，从而增强果实的抗病能力，其中60 kPa处理效果最好。