人类精子CFTR蛋白表达及其与精子活力相关性研究*

李 波 申玉行 邓晋超 韩瑞钰 马 婧 张天翼 王树松**

1.河北省中医院（河北 050011）；2.北京市昌平区南口医院（北京 102200）；3.河北中医学院研究生学院（河北 050091）；4.河北省计划生育科学技术研究院（河北 050051）

前 言

囊性纤维化跨膜传导调节因子 （cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）是一种Cl-离子通道，在雄性生育事件中有至关重要的作用[1]。CFTR蛋白表达于人类睾丸的支持细胞和生精上皮细胞，影响睾丸的生精功能[2]。在附睾头部主细胞表达强烈，对附睾液的形成以及精子的成熟具有重要的作用[3]。CFTR蛋白在人类精子的表达率与精子质量和受精能力有明显的相关性，其在生育组精子的表达率远高于畸形精子症和少弱精子症患者[4-5]。但是目前CFTR蛋白的研究[1-3]多集中在睾丸和附睾等组织，人类精子CFTR蛋白的研究主要集中在表达率方面[4-5]，其分子量的大小以及其在精子表达的部位、其表达量与精子活力的关系等方面研究较少，基于此，本课题进行了初步探索。

材料和方法

一、标本收集

（一）精液标本

从2019年7月至10月于河北省中医院男科实验室选择性留取精液30份，其中包括精子前向运动百分率（PR）等于或接近10%、20%、30%、40%、50%的标本各6份，由低到高分为5组，精液分析严格按照WHO《人类精液检查与处理实验室手册》（第5版）要求进行操作。

（二）动物标本

选取200～220g健康雄性大鼠5只，均购于北京维通利华实验动物技术有限公司，适应性分笼饲养1周，10%水合氯醛生理盐水溶液对大鼠进行腹腔麻醉后，开腹取睾丸置于冻存管，-80℃保存备用。

二、实验设备和试剂

（一）实验设备

显微镜（E800 Nikon，日本）、BY-R18型医用4℃离心机（北京白洋淀医疗器械有限公司）、SpectraMaxRiD3酶标仪（美合分子仪器有限公司）、DYY-6C型电泳仪（北京六一生物科技有限公司）、百乐垂直电泳槽（Bio-Rad公司，美国）、Minichemi320化学发光成像仪（北京赛智创业科技有限公司）。

（二）实验试剂

CFTR兔抗人多克隆抗体（TA89016，OriGene,美国）、CFTR小鼠抗人单克隆抗体(ab2784，abcam英国)、β-actin兔单克隆抗体（ABclonal）、柠檬酸钠-EDTA抗原修复液（北京索莱宝科技有限公司）、兔链霉卵白素-生物素法免疫组化检测试剂盒（中杉金桥生物技术有限公司）、DAB显色试剂盒（中杉金桥生物技术有限公司）、BCA蛋白测定试剂盒（联科生物科技有限公司）、新快速SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（北京庄盟国际生物基因科技有限公司）。

三、免疫组织化学染色

采用Percoll密度梯度离心法处理精液以获得纯净的精子混悬液，常温600g离心10分钟，取精子沉渣，PBS缓冲液洗涤后溶于4%甲醛溶液中，调整到适宜浓度固定于硅烷化的载玻片上，室温下干燥；用柠檬酸钠-EDTA抗原修复液进行抗原修复，室温冷却；避光条件下使用3%H2O2溶液孵育40min以消除内源性过氧化物酶活性；使用山羊血清避光室温封闭60min后，倾去工作液；滴加稀释比例为1:100的CFTR兔抗人多克隆抗体，空白对照以PBS缓冲液代替CFTR抗体，4℃过夜；滴加山羊抗兔IgG工作液室温孵育60min；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液室温孵育30min。以上每步操作后使用PBS缓冲液洗涤三次，去除杂质。DAB避光显色，显微镜观察染色程度，适时终止染色反应；苏木精复染1min20s；1%HCL的酒精溶液分色1～2s；0.1%氨水返蓝2min；每步操作后缓水流冲洗。将载玻片依次放入60%酒精中1min，70%酒精中1min，85%酒精中2min，95%酒精中3min，100%酒精5min×2进行梯度脱水；在二甲苯溶液中透明2次，每次5min；最后选择中性树脂封片，镜下观察CFTR在精子中的表达情况。

四、蛋白免疫印迹实验

称取0.1g大鼠睾丸组织于EP管中，加入1%PMSF的RIPA裂解液500μL，在冰浴中剪碎；精液在600g离心力下处理，精子沉渣使用PBS洗涤3次，加入1%PMSF的RIPA裂解液100μL。二者均在冰浴中转子打磨至液体均匀，4℃13000g低温离心10min取上清液，采用BCA试剂盒使用酶标仪测定蛋白浓度。取30μg总蛋白加入上样缓冲液煮沸10min变性，每孔上样15μg，经SDS-PAGE电泳分离蛋白后转膜至PVDF，室温5%脱脂牛奶封闭1.5h。然后加入一抗4℃孵育过夜，再加入HRP标记的二抗室温孵育1.5h。其中一抗稀释比例如下：CFTR兔抗人多克隆抗体为1：500，CFTR小鼠抗人单克隆抗体为1:200，二抗稀释比例为1:50000。采用化学发光凝胶成像系统检测获得条带，Adobe Photoshop CS4软件对条带进行灰度扫描检测，目的蛋白的灰度值除以内参的灰度值以校正误差，所得结果代表目的蛋白相对表达量。

五、数据统计分析

所有数据采用SPSS21.0软件进行统计学分析，其中计量资料服从正态分布，用均数±标准差（x±s）表示，组间差异比较采用秩和检验，采用Spearman进行不同变量之间的相关性分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

一、一般情况

患者的年龄为22～31岁、精子总数在7500～9500万之间，各组之间患者年龄和精子总数均无统计学差异（P＞0.05），见表1。

表1 各组患者的年龄及精液参数

二、人类精子CFTR蛋白表达部位

免疫组织化学试验结果提示，CFTR蛋白在人类精子尾部中段显著表达，在精子头部赤道板附近微弱表达，见图1。

图1 人类精子CFTR蛋白表达部位

三、人类精子CFTR蛋白的表达分子量情况

大鼠睾丸组织CFTR蛋白在75kd和168kd均有表达，人类精子CFTR蛋白75kd表达，168kd未表达，见图2。

图2 人类精子和大鼠睾丸的CFTR蛋白的表达情况

四、精子前向运动率与CFTR蛋白相关性分析

从5组精液中各随机抽取一份样本，组成一个批次进行蛋白免疫印迹法试验，共完成六个批次实验，结果提示各PR组精子的CFTR蛋白表达量随PR的升高而增加，组间差异有统计学意义（P＜0.01），结果见图3。

图3 各PR组精子75kdCFTR蛋白的情况

经过Spearman相关分析，发现精子的前向运动率（PR）与其CFTR蛋白表达量正相关，相关系数r=0.972（P＜0.01），提示人类精子CFTR蛋白表达量随着精子活力增加而逐渐提高。

五、患者的生育情况回访

30例患者在没有采取药物干预情况下，指导与妻子在排卵期同房，3月后电话回访。其中50%PR组有2例患者的妻子怀孕，1例患者的妻子因输卵管不通而采取辅助生殖；40%PR组有2例患者的妻子怀孕；30%PR组有1例患者的妻子怀孕；10%和20%PR组患者妻子没有怀孕。

讨论

CFTR广泛表达于呼吸道、胰腺及生殖道等组织的上皮细胞，参与跨上皮细胞的离子运输和液体流动，发现男子的睾丸、附睾、精子都有表达[1]。CFTR基因位于人类染色体7q31.2，全长约250kb，由27个外显子和19个内含子组成，该基因所编码的CFTR蛋白是一种cAMP依赖的离子通道，结构上属于ATP结合盒转运蛋白家族（ATP-binding cassette transporter）中的成员，与ATP代谢有关[6]。CFTR离子通道由5个结构域组成，分别是2个跨膜结构域(membrane spanning domain，MSD)，2个核苷酸结构域(nucleotide binding domain，NBD)，以及1个连接在其之间的调节结构域(regulatory domain，R)[7]。细胞内的R调控域有多个磷酸化位点，离子通道的开放依赖于R调控域的磷酸化，磷酸化促进NBDs与ATP结合，去磷酸化使之解离，从而引起MSDs的构象变化而促使通道的打开和关闭[8]。CFTR的活动与细胞能量代谢有紧密联系，当细胞活化时，ATP代谢增加，增多的cAMP可激活蛋白激酶A，并磷酸化R调控区，使CFTR通道打开；CFTR当细胞处于静息状态或细胞能量不足时，CFTR离子通道活动会受到抑制而使细胞能量得以保存[9]。

李楚艳等[10]研究发现，CFTR蛋白在人类成熟精子中存在并定位于精子头部赤道板上，本项研究也发现CFTR蛋白在人类精子的头部微弱表达，与之前学者[10]的研究一致。但是，除了头部之外，我们发现CFTR蛋白在人类精子尾部的中段表达得更明显和广泛。CFTR蛋白结构上属于ATP结合盒转运蛋白家族，其活动与细胞能量代谢有紧密联系，而精子的能量来源线粒体主要分布于尾部的中段，所以精子尾部中段表达CFTR蛋白可能与精子的能量代谢有关。

近期研究发现CFTR的生理功能不仅仅是一种离子通道，而且可能在某个位置或某个时间与广泛的合作伙伴耦合，包括离子通道、受体、转运蛋白、支架蛋白、酶、信号分子等，从而创造了相互作用的可塑性[11]。虽然CFTR基因是250kd，但其蛋白可以根据其不同的功能而选择性表达，从而出现不同的分子量。国内宾彬等[12]研究大鼠睾丸组织CFTR蛋白分子量为160kd。国外Sachin Sharma等[11]通过免疫荧光组化研究发现CFTR定位在在大鼠睾丸支持细胞的细胞核，其在睾丸、肺组织均浆表达蛋白分子量以120kd为主，睾丸组织均浆通过分馏技术分离细胞核和其他亚细胞上清液，通过Western Blot技术检测，支持细胞核CFTR蛋白表达主要为85kd，而其他亚细胞上清液CFTR蛋白表达以120kd为主。说明CFTR蛋白在睾丸组织均浆、支持细胞的细胞核及其亚细胞结构分子量是不同的。本项研究发现人类精子CFTR蛋白表达的分子量为75kd，虽然与之前学者[12]研究大鼠睾丸CFTR蛋白分子量不一致，但很接近大鼠睾丸支持细胞核CFTR蛋白85kd的分子量。人类精子是一种高度特异化的细胞，其细胞核转录是沉默的，而且细胞质和亚细胞结构很少，人类精子与大鼠睾丸组织表达的CFTR蛋白分子量存在差异说明了其功能的多样性。

本项研究发现随着精子前向运动率的升高，精子75kd CFTR蛋白的表达量也同步增加，并呈阶梯性正相关（P＜0.01），提示精子CFTR蛋白可能参与了精子活力的调节，精子的活力需要能量代谢的支撑，精子的能量代谢状况需要与之相匹配的CFTR蛋白表达，具体机制需要进一步深入研究。