兔体外循环模型心肌代谢组学研究

邹丽华，刘晋萍

体外循环（extacorporeal circulation， ECC）期间主动脉阻断与开放难以避免心肌缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury， IRI）），可能促进线粒体通透性转换孔开放、免疫系统激活、活性氧簇释放、心肌细胞水肿等［1］，因此 ECC 期间心肌保护策略需关注ECC 前的心肌代谢准备，改善ECC 诱发的炎症反应，调节心肌氧耗并进行心肌的“训练”［1］。 其中，代谢状态作为心肌能量供应及功能状况的反映，可能在ECC 期间发生复杂变化，目前临床常用的心肌保护液－HTK 液，具有酸缓冲能力、含有酮戊二酸可补充能量代谢底物、色氨酸可稳定细胞膜等优良特性。 前期研究发现HTK 液可降低主动脉开放后心肌氧耗［2］，但未全面分析心肌代谢变化。 代谢组学利用分析检测技术，如气相色谱－质谱联用（gas chromatography－mass spectrometer，GC－MS）、液相色谱－质谱联用，可对小分子代谢产物进行全面分析，有助于疾病诊断和发病机制研究［3］。 本研究旨在利用兔 ECC 模型，采用主动脉阻断与开放、HTK 液心肌灌注，模拟临床实际，对ECC期间心肌进行代谢组学分析。

1 资料与方法

1.1 实验动物 实验经动物伦理委员会批准（2012－4－10－GZR），选择 15 ～20 周龄的新西兰白兔，体重 2～3.5 kg，随机分为对照组（C 组，n ＝ 6）、缺血组（I 组，n ＝6）、缺血再灌注组（IR 组，n ＝ 6）。 12 只新西兰白兔作为I 组、IR 组献血兔用于ECC 管道预充和术中输血，具体方法同前期研究［4］。 实验动物术前禁食6 h，禁饮2 h。

1.2 耗材与试剂 ECC 模型采用16 F 静脉插管、婴儿型膜肺（Terumo Capiox FX05）、双头滚压泵，心肌灌注管采用20 G 中心静脉插管。 代谢组学分析采用气相色谱仪（Agilent 7890A，美国）、质谱仪（Ag⁃ilent 5975C，美国）、30 m×250 μm×0.25 μm 毛细管柱（Agilent DB－5MS，美国）。 代谢组学内标采用 L－2－氯苯丙氨酸，衍生化试剂采用N，O－双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺。

1.3 ECC 模型建立 入室开通耳缘静脉，麻醉诱导依次采用芬太尼（3 μg／kg）、戊巴比妥钠（30 mg／kg）、维库溴铵（0.1 mg／kg），经口气管插管机械通气。 麻醉维持采用戊巴比妥钠、芬太尼、维库溴铵。右腋动脉置入16 G 套管针，正中开胸，充分暴露心脏和升主动脉，右心耳置入16 F 静脉插管。 左腋动脉置入20 G 中心静脉导管入主动脉根部作为心肌灌注。 ECC 管道预充排气后开放静脉引流管、腋动脉插管，开始ECC 转流，肛温降至30℃阻断主动脉，灌注 HTK 液 40 ml／kg。 ECC 期间维持肛温 28℃ 左右，平均动脉压为40 ～60 mmHg。 主动脉开放前肛温复温至30℃，主动脉阻断120 min 后松开阻断带，恢复心肌灌注、心脏复跳，继续复温至35℃，血流动力学平稳后停机。 I 组主动脉阻断120 min 后取心肌组织，IR 组主动脉阻断120 min 开放，心肌恢复灌注120 min 后取心肌组织。 C 组正中开胸、ECC 插管后取左室心肌组织，心肌标本－80℃冰箱保存，用于代谢组学检测。

1.4 代谢组学GC－MS 检测 取100 mg 心肌组织，加入 L－2－氯苯丙氨酸（50 μl）、体积比 3 ∶1 的甲醇氯仿混合液（0.5 ml），55 Hz 研磨 7 min 后离心 15 min（4℃，12 000 rpm），取上清行真空浓缩器干燥处理，与80 μl 甲氧胺盐试剂混匀，37℃孵育 2 h 后加入 100 μl BSTFA，70℃孵育 1 h，冷却后上机检测。采用 GC－MS 分析，进样量为1 μl，气载为氦气，气体入口流速设为3 ml／min，毛细管柱气体流速1 ml／min。 初始温度 80℃ 1 min，以 10℃ ／min 提升至290℃，并维持 290℃15 min。 选择单纯内标（L－2－氯苯丙氨酸）、单个样本进行预实验，内标保留时间标准差为0.00531，表明系统稳定性良好。

1.5 代谢组学多元数据分析 质谱峰预处理去除噪音数据，采用最小值二分之一法缺失值模拟，内标归一法数据标准化处理。 采用主成分分析法（prin⁃cipal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法－判别分析（orthogonal projections to latent structuresdiscriminant analysis，OPLS－DA）对数据进行多元分析，应用得分图评估样本分类。 PCA 采用对数转换及CTR 格式化处理的数据标度换算方式，对数据进行建模分析。 OPLS－DA 滤除代谢物中不相关的正交变量，对非正交变量和正交变量分别分析，最大化凸显模型内部与预测主成分间的差异。 OPLS－DA采用对数转换及UV 格式化处理的数据标度换算方式，对第一、二主成分进行建模分析。 采用7 折交叉验证检验模型质量，R2Y（Y 变量的可解释性）及Q2（模型的可预测性）评估模型有效性，排列实验随机200 次改变Y 的排列顺序获得Q2值进一步检验模型有效性。

1.6 差异物代谢通路及统计学分析 所有数据使用 SIMCA－P 13.0 进行分析，计算 OPLS－DA 第一主成分的变量重要性投影值（variable importance in the projection，VIP）的阈值，采用 LECO／Fiehn 代谢组学对代谢物质进行鉴定［5］。 所有数据采用 SPSS 16.0进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验。 VIP 值＞1 及t检验P＜0.05 鉴定差异代谢物。 差异代谢物以 Pearson 相关系数进行聚集获得热图，采用MeV 软件作载荷图。将差异物在京都基因与基因组百科全书数据库（kyoto encyclopedia of genes and genomics database，KEGG）中进行映射，确定代谢通路。

2 结 果

2.1 代谢组学多元分析

2.1.1 预处理结果 三组心肌组织GC－MS 检测获得608 个质谱峰，对数据进行过滤，去除噪音数据，保留583 个峰值（图1）。

图1 GC－MS 总离子流图

2.1.2 PCA 分析结果 所有样本处于 95%置信区间内，I 组与C 组PCA 得分图部分重叠区分不显著，R2X＝0.384，Q2＝－0.102。 IR 组与 I 组分布于 T1 两侧，互不重叠具有聚类趋势，表明再灌注期间的心肌代谢物质可能发生显著改变，PCA 模型R2X ＝0.535，系统稳定性和实验可控性良好，数据可进一步分析（图 2～3）。

2.1.3 OPLS－DA 分析结果 所有样本处于 95%置信区间内，OPLS－DA 得分图示I 组与C 组无重叠，R2X＝0.313，R2Y＝0.987，Q2＝ 0.357。 I 组与 IR 组显著区分，表明ECC 可引起心肌代谢状态的显著改变（图 2～3），OPLS－DA 模型 R2X＝0.403，R2Y ＝0.991，Q2＝ 0.714。

图2 C 组与 I 组 PCA 及 OPLS－DA 得分图

OPLS－DA 模型行 7 折交叉验证，I 组与 C 组比较发现置换检验截距分别为 R2＝0.904，Q2＝0.0165，IR 组与 I 组比较发现置换检验截距分别为R2＝0.914，Q2＝－0.0841，OPLS－DA 模型的稳健性良好，不存在过拟合现象，OPLS－DA 模型可解释两组样本之间的差异。 缺血期间及再灌注期间代谢物载荷图见图4，载荷图左右两端物质为潜在的差异代谢物。

图4 缺血再灌注期间代谢物载荷图

图3 R 组与 I 组 PCA 及 OPLS－DA 得分图

2.2 差异代谢物鉴定及代谢通路确定 差异代谢物热图表明，缺血期间代谢变化不显著，仅发现13个差异物质（图5A），再灌注期间代谢发生明显改变，共筛选出82 个差异代谢物（图5B）。 KEGG 分析发现缺血期间不饱和脂肪酸油酸代谢上调，尿嘧啶代谢下调，包括尿嘧啶核苷、5，6－二氢尿嘧啶生成减少。 尿素循环相关产物瓜氨酸、肌酐生成减少，差异代谢物主要参与嘧啶代谢、尿素循环以及不饱和脂肪酸代谢。 再灌注期间主要涉及氨基酸代谢、不饱和脂肪酸代谢、核苷酸代谢。 再灌注期间上调的差异氨基酸主要为缬氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、瓜氨酸、肌氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丝氨酸。参与氧化应激的氨基酸上调，包括丝氨酸、甘氨酸、脯氨酸、苏氨酸，鸟氨酸循环激活，谷氨酰胺在再灌注期间生成减少。 再灌注期间脂肪酸代谢中十五酸、棕榈酸（十六酸）、十七酸、硬脂酸（十八烷酸）、茉莉酸甲酯、甘油酸、双甘油、花生四烯酸、油酸、亚油酸生成增加，其中不饱和脂肪酸花生四烯酸、油酸、亚油酸、茉莉酸甲酯代谢上调。 再灌注期间核苷酸代谢中尿嘧啶、胞嘧啶核苷、鸟嘌呤、次黄嘌呤、尿酸、黄嘌呤核苷生成增加，羧酸尿嘧啶、胞苷酸、尿苷酸生成减少。 核苷酸代谢产物增加，与黄嘌呤氧化酶系统相关的产物次黄嘌呤、黄嘌呤核苷均增加，而参与了ADP 合成的底物腺苷及三羧酸循环琥珀酸生成减少（图6）。

图6 再灌注期间主要差异物代谢通路

3 讨 论

ECC 期间受人工管道、低温等因素的影响，缺血再灌注期间心肌代谢可能发生显著改变。 HTK液诱导新陈代谢暂停、维持有利的代谢环境，防止细胞代谢物的丢失、维持合理的酸碱平衡，防止细胞毒性损伤［6］，但围术期心功能紊乱仍常见于临床，而从心肌代谢角度阐释可能的机制仍需进一步探索。研究证实ECC 期间心肌腺苷酸发生显著改变，ECC可能诱发了能量受损及恢复延迟，有学者采用丙酮酸改善心肌能量代谢［7］。 Mantovani 应用微透析技术发现，ECC 缺血期间能量代谢（葡萄糖、丙酮酸）下调，再灌注期间逐渐恢复。 目前代谢检测方法由血浆代谢物检测发展为微透析检测，近年来代谢组学的兴起为全面的代谢分析提供了新思路［6，8］，因此本研究采用GC－MS 全面反映ECC 心肌代谢变化特点。 本研究 OPLS－DA 分析发现经 HTK 液灌注后缺血期间心肌代谢改变不显著，再灌注期间代谢发生显著差异，KEGG 代谢通路分析发现，ECC 再灌注早期氨基酸代谢、核甘酸代谢及不饱和脂胞酸代谢明显上调，但同时参与了氧化应激的氨基酸、不饱和脂肪酸、黄嘌呤系统均上调，与腺苷相关代谢产物及琥珀酸等能量代谢物明显下调。

与缺血期相比，心肌再灌注后氨基酸代谢产物明显增加，可能与ECC 期间能量代谢物相对缺乏、促进白质分解有关。 既往研究发现在缺血等病理状态下，心肌代谢重构，氨基酸可作为能量底物的直接来源，参与葡萄糖代谢酶的活性，同时氨基酸摄取增加以抵消氧利用率降低对细胞的有害影响［9］，本实验中采用HTK 液及低温进行心肌保护，未检测到缺血期间氨基酸代谢显著下调，表明缺血期间HTK液、低温等因素可能具有较好心肌保护效果。 此外，氨基酸可改善氧化应激，抵消氧自由基的作用，氧自由基是谷胱甘肽合成的前体，或一氧化氮生物合成的底物［9］，其中丝氨酸、甘氨酸、脯氨酸、苏氨酸被证实参与氧化应激，再灌注期间显著增加，参与抗氧化应激的谷氨酰胺明显下降，与既往研究一致，因此改善ECC 再灌注期间心肌保护可能仍需进一步降低氧化应激损伤。

核苷酸代谢与心肌能量代谢、氧自由基的产生密切相关，其中黄嘌呤氧化酶系统是参与心肌IRI机制中的氧自由基主要来源［10］。 缺血期间ATP 分解，产生大量次黄嘌呤和黄嘌呤，再灌注血供和氧供的恢复促进黄嘌呤氧化酶生成尿酸，同时释放大量O2

－产生氧化应激损伤［11］，本研究中再灌注期间次黄嘌呤、尿酸、黄嘌呤核苷显著上调，推测氧自由基可能是兔ECC 模型再灌注损伤重要机制。 此外，腺苷代谢物及琥珀酸明显下调，证实ECC 期间心肌可能存在能量转移、利用以及生成障碍。

ECC 期间不饱和脂肪酸代谢上调，其上调可能与ECC 期间交感神经兴奋激活β 受体有关。 本研究发现，油酸在缺血期间增加、再灌注期间进一步增加。 油酸分解耗氧较多，缺血期间心肌氧供骤减使得油酸分解下降，且心肌缺血期间对脂肪酸利用减少进而引起油酸的相对升高。 花生四烯酸为脂质过氧化物的主要来源，前期研究发现，脂质过氧化物终产物不饱和醛参与了ECC 期间的心肌损伤，醛类在心肌缺血期间堆积，再灌注期间水平降低但再灌注早期显著高于术前，因此不饱和脂肪酸的上调可能参与了ECC 期间醛类堆积及心肌损伤的重要机制，与前期研究结果一致［12］。 既往研究结果证实，心肌缺血再灌注期间脂肪酸β 氧化的增强，但脂肪酸β氧化增强与心肌能量代谢改善不呈正相关，可能的机制为脂肪酸β 氧化加速使ATP 产生增多，但同时再灌注期间耗氧增加，因此心肌能量仍处于失衡状态，与本研究结果一致，本研究观察到再灌注期间腺苷相关代谢物及琥珀酸显著下调。

综上所述，本研究全面分析了ECC 期间心肌组织的代谢特点，发现ECC 再灌注期间氨基酸代谢上调、不饱和脂肪酸生成增加、黄嘌呤氧化酶系统活化，本研究从心肌代谢角度探索可能心肌IRI 机制，将有助于减轻缺血再灌注损伤策略改进。