叶酸修饰碳点的制备及其靶向细胞成像应用

李志平，张俊莉，双少敏，路雯婧*

（1. 山西大学 化学化工学院，山西 太原 030006；2. 山西众智环境损害司法鉴定中心，山西 太原 030006）

0 引言

碳基材料由于其突出的优点如良好的化学稳定性、生物相容性和低毒性等，受到越来越多的关注，并因其优异的性能被广泛应用于各个领域［1-2］。其中，由于碳点（CDs）具有可调的光学特性、化学稳定性、生物相容性、低毒性、特殊的光电性质和催化活性等优点，被应用于化学探针、生物传感器、药物载体、靶向标记物、光电器件等诸多方面［3-8］。碳点作为一种重要的碳基材料，在化学、生物、环境、物理等多学科成为研究热点。

由于碳点卓越的发光性能、良好的生物相容性和低毒性，基于荧光碳点的生物成像技术成为探究生物体内微环境的有效手段之一，并且可以实现对疾病的生物标记物进行可视化评估［9-12］。然而，目前报道的碳点的荧光发射波长大多集中在蓝光到绿光区域，这限制了它们在生物医学和光电子器件中的进一步应用。由于生物基体的自发荧光通常集中在短波长区域，会对生物体成像产生一定干扰。因此，开发一种简便的宏量制备长波长（如黄光或红光）荧光碳点的方法具有一定的应用意义［13-17］。

癌症严重威胁着人类的健康和生命。癌症的早期诊断越来越面临严峻的挑战，已成为世界性的重大医学难题和亟待研究解决的科学问题。因此，寻找有效的癌症早期诊断方法是预防并及时治疗恶性肿瘤的关键。光学成像作为一种新兴的影像技术，在灵敏度和分辨率方面显示出极大优势，尤其是基于纳米技术的光学成像探针的应用，使其在癌症的光学成像和诊断方面具有良好的发展前景和应用价值［18-23］。碳点以其优良的光化学性质在细胞标记和活体成像领域展现出良好的应用潜力。然而，通常制备的碳点在生物体内的分布没有选择性，无法精确地集中于病灶部位，清晰区分肿瘤组织与正常组织，导致靶向成像效果不明显。因此，需要发展具有肿瘤靶向功能的荧光碳点以满足生物医学应用需求。在碳点表面修饰靶向基团或分子将其进行功能化，使其与细胞内/外特定分子进行相互作用，是实现多功能碳点对细胞或细胞器的靶向成像的重要途径之一［24-30］。

基于以上原因，本文通过低温浓酸加热法制备黄色荧光碳点，该碳点不仅具有良好的光学稳定性，而且可以避免生物基质的自发蓝色荧光，在生物成像领域具有良好的应用潜力。因此，我们通过酰胺化反应将其表面修饰叶酸分子，使其具有癌细胞靶向功能。将叶酸功能化的荧光碳点用于混合细胞（正常细胞和癌细胞的混合培养）的成像研究中，结果表明该碳点可以根据细胞表面叶酸受体表达水平的高低，对癌细胞进行灵敏的荧光识别，从而有望达到对癌细胞的早期诊断效果。

1 实验部分

1.1 试剂和仪器

1. 主要试剂：葡萄糖、葡萄糖胺、麦芽糖、乳糖、葡聚糖和β-环糊精购自上海阿拉丁试剂公司。1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、氢氧化钠和浓磷酸购自天津恒心化学试剂有限公司。叶酸（FA）购自美国Sigma-Aldrich 化学试剂公司。所有实验用药品和试剂均为分析纯，且未经额外处理直接使用。实验用水为超纯水由美国Milli-Q 超纯水仪制得（电阻率=18.25 MΩ•cm）。

2. 主要仪器：透射电子显微镜JEM-2100（日本电子株式会社JEOL），傅立叶变换红外光谱仪Cary670（美国安捷伦Agilent 科技公司），X 射线光电子能谱仪ESCALAB 250Xi（美国Thermo Fisher科技公司）。紫外可见吸收光谱仪U-2910 和荧光光谱仪F-4500（日本日立公司），瞬态/稳态荧光分光光度计FLS920（英国爱丁堡公司），激光共聚焦显微镜FV1000（日本Olympus 公司）。

1.2 黄色荧光碳点的宏量制备

分别称取0.5 g 不同相对分子量的单糖和多糖物质（葡萄糖、葡萄糖胺、麦芽糖、乳糖、葡聚糖和β-环糊精），加入于1 mL 超纯水中，微热后使其溶解完全。向溶液中加入1 mL 浓磷酸充分混合后，90 ℃加热15 min ～ 60 min，最终得到深黄色CDs 溶液。冷却至室温后用碱溶液调至中性将上清液通过（截留分子量，MWCO¼ 500～1000）透析膜透析72 h。最后，将澄清的浅黄色溶液经过冷冻干燥后得到CDs 固体。

1.3 叶酸修饰碳点的制备

叶酸修饰碳点选取以葡萄糖胺为碳源所制得的碳点进行修饰，采用EDC/NHS 交联法合成FACDs。 分 别 称 取0.018 g FA、0.0153 g EDC、0.0187 g NHS、0.1 g CDs 于离心管中，依次分别加入5、1、1、2 mL PBS 缓冲溶液（0.01 mol/L，pH=7.4），使其完全溶解。在烧瓶中先后加入FA、EDC、NHS 溶液，搅拌30 min 后再加入CDs 溶液，继续反应24 h。反应结束后将溶液转入透析袋（截留分子量，MWCO¼ 500～1 000）进行透析，每隔一定时间取袋种溶液测量其紫外-可见吸收光谱，直到吸光度不变。随后将袋内溶液冷冻干燥处理后得到FA-CDs 固体粉末。注：为避免FA 失活，整个反应过程遮光进行。

1.4 细胞毒性检测

用于细胞毒性试验的细胞为PC-12、MCF-7 和SMMC 7721 细胞系。首先，将三种细胞分别加入96 孔细胞培养板中在37℃，体积分数为5.0% CO2培养箱内孵育3 h。随后，用200 μL 含有不同溶度CDs 或FA-CDs 新鲜的DMEM 培养基再进行孵育24 h，记为实验组，每组至少含有6 个平行样本。将未加入细胞但用CDs 或FA-CDs 处理过的孔记为空白组。随后在每个孔内加入20 μL，5.0 mg/mL的MTT 试剂并进一步孵化5 h。移除含有MTT 的培养基后加入150 μL DMSO 溶液，并且将混合物在室温下震荡约10 min。利用酶标仪测定在490 nm 处混合物的光密度（OD）。细胞存活能力用公式（1）估算：

细胞存活率（%）=（OD 实验组/OD 对照组）×100%

（1）OD 实验组为加入CDs 或FA-CDs 的细胞光密度，OD 对照组为未经CDs 或FA-CDs 处理的细胞光密度。

1.5 细胞成像

将 分 别 铺 有PC-12、MCF-7 和SMMC 7721 三种细胞系的共聚焦培养皿中加入含有100 mg/mL CDs 或FA-CDs 的DMEM 培 养 基 后 孵 育3 h，去 除多余培养基，用1.0 mL PBS 缓冲液（pH=7.4）洗涤3 次。将培养皿置于Olympus FV1000 激光共聚焦显微镜下观察细胞形态及荧光现象。

2 结果与讨论

2.1 黄色荧光碳点的制备

选取不同相对分子质量的糖类物质（例如葡萄糖、葡萄糖胺、麦芽糖、乳糖、葡聚糖和环糊精）为碳源，通过浓磷酸加热碳化，经纯化处理后制备了六种荧光碳点（图1）。所得碳点均可以发出明亮的黄色荧光，最佳发射峰位于535 nm～ 543 nm 之间，荧光产率在18% ～23% 之间，合成产率为11% ～18%。经过实验可知，当前驱体浓度和加热温度相同时，得到碳点所需的碳化时间与碳类物质的相对分子量成正相关，糖类相对分子质量越小，所需碳化时间越短。我们推测这一现象是由于双糖与多糖在浓酸热解的过程中先被水解成单糖，再经过脱水聚合形成碳点。经过筛选最佳实验条件，最终选择以含有氨基的葡萄糖胺为碳源，不仅可以缩短反应时间，而且制备的碳点表面富含氨基便于进一步修饰。通过筛选原料比例、反应温度及反应时长，最终选择葡萄糖胺浓溶液和浓磷酸的体积比VN-Glu：VSPA为1：1，反应温度为90 ℃，碳化时间为20 min 时，所制备的碳点量子产率和合成产率最高。量子产率为23.56%，合成产率为18.11%，以上结果说明该方法有望实现宏量制备黄色荧光碳点。

图1 黄色荧光碳点的合成路线Fig. 1 Schematic of synthesis of yellow fluorescent CDs

2.2 碳点的形貌表征和光谱性质

采用透射电子显微镜（TEM）观察碳点的形貌，TEM 图（图2 A）清楚地显示，CDs 为单分散的纳米颗粒，粒径分布较窄在2 nm～ 7 nm 范围内，平均直径为4.5 nm（图2 B）。通过元素分析和傅立叶变换红外光谱（FT-IR）对CDs 进行了元素和表面结构分析。通过元素分析可知碳点含有C、O、N 和H 四种元素，对应的含量分别为53.2%、31.1%、7.2%和8.5%。如图2 C，FT-IR 光谱所示在3 400 cm-1处有一个宽吸收峰是由O-H 拉伸振动引起的。2 967 cm-1、1 651 cm-1和1 423 cm-1处 的 尖 峰 分 别对应于C-H、C=O 和C=C。1 272 cm-1处的吸收峰 归 因 于C - O 键。 此 外，在1 553 cm-1和1 063cm-1的吸收峰的归因于CDs 的N-H 的面内弯曲振动和C-N 的拉伸振动。这些结果均表明了氮元素成功掺杂在碳点中，并且以不同形式的含氮结构存在（例如氨基），这为碳点的进一步功能化提供有利条件。

图2 CDs 的TEM 图（A），粒径分布（B），FT-IR 光谱（C）Fig.2 (A)TEM image,(B)the size distribution,(C)FT-IR spectra of CDs

利用紫外可见吸收光谱、荧光光谱和荧光量子产率研究CDs 的光学性质。在紫外可见吸收光谱中（图3A），CDs 在283 nm 和350 nm 出现两个明显的吸收峰。283 nm 处的吸收峰可能是CDs 中C=C键的π-π*跃迁，350 nm 处的吸收带可能是附着在CDs 表面的各种官能团，例如C=O 键的n-π*跃迁引起的。图3B 插图所示，将CDs 置于365 nm 紫外光照射下，可观察到明亮的黄色荧光。在荧光光谱中，CDs 在最佳激发波长λex为380 nm 时的最大发射波长λem在542 nm，并且其发射光谱具有激发独立性（图3B）。此外，以罗丹明B 为参照，计算出CDs的QY 可达到23.56%。

图3 CDs 的紫外吸收及荧光光谱（A），在不同激发波长下的荧光发射谱（B），插图：日光（左）和紫外光（右）照下的Y-CD 照片Fig. 3 (A)UV-Vis absorption and FL spectra of the CDs. (B)FL spectra of the CDs under different excitation conditions. Inset:the pictures of Y-CDs under daylight(left)and 365 nm UV light(right)

2.3 叶酸修饰碳点的表征

通过以上对碳点的表征可知，碳点表面含有丰富的氨基，易与叶酸通过酰胺化反应。因此，我们在碳点表面修饰具有癌细胞靶向功能的叶酸，制备出叶酸修饰碳点（FA-CDs）用于癌细胞靶向定位。通过测定FA、CDs 和FA-CDs 的紫外-可见吸收光谱、红外吸收光谱和Zeta 电位表征所合成的FACDs。如 图4A 所 示，FA 在345 nm 有 明 显 的 吸 收峰。同时，与CDs 相比，FA-CDs 在353 nm 处的吸收峰明显增强，表明碳点表面连接有FA 结构。此外，通过FT-IR 光谱（图4B）可以看出，在1 606 cm-1和1 695 cm-1处，FA-CDs 展现出与FA 相同的红外吸收峰，对应叶酸中苯环与蝶呤结构。然而CDs 并未有这些吸收带。FA-CDs 在1 680 cm-1的吸收峰为酰胺键中C=O 的伸缩振动。另外，在pH=7 的环境中，经过FA 修饰的碳点的Zeta 电位从-9.6 mV 降到-13.8 mV，这一现象是由于CDs 表面的氨基与强负电性的FA 发生相互作用，使得FACDs 的电位下降。以上结果都证明了FA 被成功地修饰到碳点表面。与此同时，通过测定相同浓度的CDs 与FA-CDs 在350 nm 的吸光度，计算出FA 在CDs 表面的固定量约为132 μg/mg。

图4 FA、CDs 和FA-CDs 的紫外-可见吸收光谱（A）和FT-IR 光谱（B）Fig. 4 UV-Vis absorption(A)and FT-IR(B)spectra of CDs,FA and FA-CDs

2.4 碳点和叶酸修饰碳点的光稳定性

首先，通过荧光光谱考察修饰的FA 是否影响碳点的荧光性质。如图5A 所示，功能化碳点的荧光发射波长和荧光强度几乎不受FA 的影响，FACDs 作为靶向生物试剂有望实现癌细胞的靶向成像。另外，通过光照时间、pH 和离子强度对两种碳点荧光性质的影响探究了两种碳点的光学稳定性。结果表明CDs 和FA-CDs 的相对荧光强度在pH 值为3～11 范围内保持相对稳定（图5B）。从图5C 可以看出，即使在高离子强度的溶液环境中（NaCl，2 M），CDs 和FA-CDs 均具有良好的耐盐性。如图5D-E 所 示，CDs 和FA-CDs 在 紫 外 光 和 日 光 连 续照射6 h 后，两种碳点的荧光强度的变化非常微弱。另外，当两种碳点在4 ℃冰箱存放30 d 后，其荧光性质仍不受影响。以上结果说明两种碳点具有良好的发光稳定性。这些优异的光学稳定性表明，该方法合成的碳点作为荧光探针在分析复杂样品方面具有很大的潜力。

图5 CDs 和FA-CDs 的荧光光谱图（A）；不同pH（B）；不同离子强度（C）；在可见光（D）、紫外光连续照射6 h（E）和低温存储不同时间下（F）CDs 和FA-CDs 的相对荧光强度Fig. 5 (A)FLspectraof CDs and FA-CDs;(B)Effectof pH;(C)Effectof ionicstrengthonFLintensityof CDs andFA-CDs;(D)Effect of visiblelight,(E)UVlightand(F)cryogenicstoragetimeonFLintensityof CDsandFA-CDs

2.5 碳点和叶酸修饰碳点的细胞毒性及生物成像研究

为了验证碳点在生物体系的适用性，首先，我们考察了Na+、K+、Mg2+、Ca2+、葡萄糖、GSH、人血清白蛋白（HSA）、牛血红蛋白等在活细胞中多种共存物质对CDs 和FA-CDs 的荧光发射的影响。如图6 所示，两种碳点的荧光强度在引入浓度较高的常见生物相关物质后变化不明显，几乎不受共存物的干扰。这说明该荧光探针具有较好的生物稳定性满足生物成像应用的要求。其次，我们采用标准MTT 法检测两种碳点的细胞毒性，并评价其在细胞成像中的应用潜力。如图7 所示描述三种不同的细胞系：神经PC-12 细胞、人乳腺癌MCF-7 细胞和人肝癌SMMC 7721 细胞与不同浓度（10 mg/mL～500 mg/mL）的CDs 和FA-CDs 共同赋予24 h 后，依旧表现出良好的细胞活性。即使两种碳点的浓度高达500 mg/mL 时，细胞的存活率仍然均超过80%。这体现了两种细胞的低毒性及其在活细胞内成像的巨大潜力，并且修饰FA 不会影响CDs 的细胞毒性。

图6 共存干扰物对CDs 和FA-CDs 荧光强度的影响Fig. 6 Effect of potentially interfering substances for CDs and FA-CDs

图7 不同浓度CDs 或FA-CDs 与（A）PC-12，（B）MCF-7 and（C）SMMC 7721 细胞共孵育24 h 后细胞的存活率Fig. 7 Cytotoxicity testing results of CDs and FA-CDs on(A)PC-12,(B)MCF-7 and(C)SMMC 7721 cells viability. The values represent percentage cell viability(mean%±SD,n=6)

选 取PC-12、MCF-7 和SMMC 7721 细 胞 为 模型细胞，研究FA-CDs 靶向标记叶酸受体（FR）过表达癌细胞的能力。将CDs 和FA-CDs 分别与三种细胞共孵育，通过激光共聚焦显微镜观察细胞成像结果。如图8 所示，三种细胞与CDs 共孵育后，可观察到三种细胞中均出现黄色荧光，表明CDs 具有良好的细胞通透性可以进入细胞，然而本身没有靶向识别的作用。如图9 所示，观察经过FA-CDs 共孵育后的三种细胞，PC-12 细胞中几乎无荧光，MCF-7 和SMMC 7721 细胞呈现出黄色荧光，其中MCF-7 细胞中的荧光最强，说明FA-CDs 标记该细胞的能力最强，这与三种细胞表面的FR 受体表达量有关，细胞FR 受体越多，叶酸功能化碳点在细胞中的积累越多。 因为，PC-12 细胞无FR 受体，SMMC7721 细胞表面的FR 受体水平低于MCF-7细胞，实验现象正与这一规律相符。此外，将FACDs 与PC-12 和MCF-7 的混合细胞共孵育后，观察细胞成像结果。如图10 所示，在混合细胞中，只有FR 受体高表达的MCF-7 细胞中观察到明亮的黄色荧光，而在PC-12 细胞中几乎无荧光，说明FA-CDs 可以在复杂的混合细胞体系中准确识别出FR 受体高表达的癌细胞。FA-CDs 作为荧光标记材料在临床癌症早期诊断中具有良好的发展潜力。

图8 PC-12（A-C）、SMMC 7721（D-F）、MCF-7 细胞（G-H）分别与CDs 共孵育后的激光共聚焦扫描显微镜图像。（A D G）为暗场；（B E H）为明场；（C F I）为叠加图像。（标尺为20 μm）Fig. 8 Laser scanning confocal microscopy images of PC-12(A-C),SMMC 7721(D-F),MCF-7(G-H)cells incubated with CDs.(A D G)panels are dark field;(B E H)panels are bright field;(C F I)panels are the merged images. All scale bars represent 20 μm

图9 PC-12（A-C）、SMMC 7721（D-F）、MCF-7 细胞（G-H）分别与FA-CDs 共孵育后的激光共聚焦扫描显微镜图像。（A D G）为暗场；（B E H）为明场；（C F I）为叠加图像。（标尺为20 μm）Fig. 9 LCMI of PC-12(A-C),SMMC 7721(D-F),MCF-7(G-H)cells incubated with FA-CDs. (A D G)panels are dark field;(B E H)panels are bright field;(C F I)panels are the merged images. All scale bars represent 20 μm

图10 PC-12 和SMMC 7721 混合细胞与FA-CDs 共孵育后的激光共聚焦扫描显微镜图像。（A）为暗场；（B）为明场；（C）为叠加图像。（标尺为20 μm）Fig. 10 LCMI of PC-12 and SMMC 7721cells incubated with FA-CDs. (A)panel is dark field;(B)panel is bright field;(C)panel is the merged image. All scale bars represent 20 μm

3 结论

以一系列不同分子量糖类物质为碳源，通过浓酸碳化的方法实现了黄色荧光碳点的宏量制备。研究结果表明碳点所需碳化时间和糖类物质的相对分子量成正相关。选取葡萄糖胺为前驱体，通过优化实验条件可制备出QY 高达23.56%的黄色荧光碳点。将其表面通过酰胺键修饰叶酸分子，成功构建了癌细胞靶向荧光碳点FA-CDs。所制备的FA-CDs 光学性质稳定，细胞相容性好，毒性低，并且不受生物体系其他共存物的干扰。其通过FA 与癌细胞FR 受体相互作用，能够作为荧光标记物在混合细胞中有效识别癌细胞，证明该荧光探针在癌症的早期诊断中表现出良好的应用潜力。