飞蝗核受体LmE75D的表达和功能初步分析

郭俊，张学尧，张建珍，刘晓健*

（1. 山西大学 应用生物学研究所，山西 太原 030006；2. 山西大学 生命科学学院，山西太原 030006）

0 引言

核受体可与特异的配体结合，通过调控下游基因的表达在生命体中发挥重要作用，分7 个亚家族：NR0、NR1、NR2、NR3、NR4、NR5 和NR6［1］。核受体一般包括5 个结构域：一个非依赖配体的激活结构域（A/B 结构域）、DNA 结合域（C 结构域）、铰链连接域（D 结构域）、配体结构域（E 结构域）和F 结构域［2］，每个结构域都具有特定的结构和功能，E75核受体属于NR1 亚家族，命名为NR1D3。目前对E75 基因的研究多集中在完全变态昆虫中，如埃及 伊 蚊（Aedes aegypti）［3］、烟 草 天 蛾（Manduca sexta）［4］、大蜡螟（Galleria mellonella）［5］、云杉芽卷蛾（choristoneura fumiferana）［6］、家 蚕（Bombyx mori）［7］、印度谷螟（Plodia interpunctella）［8］、欧洲蜜蜂（Apis mellifera）［9］、赤拟谷盗（Tribolium castaneum）［10］、德国小蠊（Blattella germanica）［11］等。根据A/B 结构域的不同，E75 可分为多个亚型，如家蚕中有3 个亚型［12］，马铃薯甲虫有3 个亚型［13］，各亚型均受蜕皮激素（20-hydroxyecdysone，20E）调控且具有时间和空间特异性差异表达特性。如马铃薯甲虫LdE75的3 个亚型基因均在体壁低表达，而在中肠、腹神经节等多个组织高表达，且具有相似的发育表达特性［13］。本课题组前期克隆获得E75 的3 个亚型：LmE75A、LmE75B和LmE75C，三者仅在A/B域不同，其余结构域相同。研究发现3 个LmE75亚型基因具有不同的组织表达特性；LmE75A在体壁和肌肉中高表达，其次是触角和前肠；LmE75B在体壁中高表达，其次是前肠；LmE75C特异性在体壁高表达［14］。

对E75 功能研究表明，E75 参与蜕皮激素信号途径，且在其中扮演至关重要的作用。如在马铃薯甲虫中取E75 不同亚型的共同区域进行RNAi，影响蜕皮激素和保幼激素的滴度从而调控相关信号通路，最终导致马铃薯甲虫化蛹困难而死亡［13］。黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）突变所有的E75亚型严重影响胚胎的存活且缺失E75 品系的细胞在卵黄生成中期即停止发育［15］。不完全变态昆虫德国小蠊中5 个E75 亚型，全部亚型基因沉默后大部分个体无法正常蜕皮而死亡［11］。

飞蝗（Locusta migratoria）属于不完全变态昆虫，且是农业生产上的重要害虫，目前主要使用有机磷等化学杀虫剂和真菌微生物农药进行害虫防治，化学农药的残留危害环境和人类健康［16］。RNA干扰是由dsRNA 诱发的特异性转录后基因沉默现象［17］。近年来，RNAi 技术因其具有高度特异性、高效性以及相对安全性等特点，在害虫防治中展现了极大的潜力，并被称为第四代杀虫剂的核心技术。本文阐明了飞蝗LmE75基因的功能，为基于RNAi的飞蝗防治提供分子靶标。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

飞蝗虫卵由河北省沧州市建民虫业公司提供。将虫卵置于孵化盒中进行孵化，期间喷洒适量水以保持沙土潮湿，孵化出的一龄若虫转移至25 cm×25 cm×25 cm 的纱笼中，在温度为（30±2）℃，相对湿度为（40±10）%，光照14 h、黑暗10 h 的养虫室中饲养，饲喂新鲜的小麦苗，待其生长发育至3 龄若虫期开始辅以麦麸饲喂。

1.2 LmE75D基因cDNA序列分析

课题组前期已获得飞蝗E75 的3 个亚型：LmE75A、LmE75B和LmE75C，后基于前胸腺转录组数据库搜索又获得1 条E75D cDNA 序列。利用NCBI 网站中（http：//cms.ncbi.nlm.nih.gov）ORF Finder 软件明确LmE75D基因的开放阅读框序列。利用ExPASy 网站中（https：//www.expasy.org/）translate 软件将LmE75D基因开放阅读框序列翻译为氨基酸序列，pI/Mw 软件预测LmE75D 蛋白分子量（Mw）及等电点（pI）。利用SMART 软件分析预测E75D 的蛋白结构域，并和其他3 个飞蝗E75 亚型结构域进行比较，SignalP 分析E75 是否具有信号肽。运用GENEDOC 软件将LmE75A、LmE75B、LmE75C和LmE75D特异性的A/B 域核苷酸进行比对，分析核苷酸一致度；运用GENEDOC 软件将4个飞蝗LmE75 亚型氨基酸序列与马铃薯甲虫（LdE75A、LdE75B 和LdE75C）和 德 国 小 蠊（BgE75A、BgE75C 和BgE75E）氨基酸序列进行比对，分 析 其DNA 结 合 域（DNA-binding domain，DBD）和 配 体 结 构 域（Ligand-binding domain，LBD）。

1.3 LmE75D mRNA表达特性分析

为了研究LmE75D在不同组织和发育时期的表达特性，选取5 龄第2 天（N5D2）飞蝗，在体视显微镜下解剖触角、脑、前肠、胃盲囊、中肠、后肠、精巢、卵巢、体壁、脂肪体和翅11 个组织，选取并解剖4龄 第1－5 天（N4D1-N4D5）和5 龄 第1－7 天（N5D1-N5D7）飞蝗若虫2－3 腹节处体壁并冻存于液氮中，－80 ℃保存备用。4 个生物学重复，每个重复4 头试虫。

上述样本RNA 的提取按照RNAisoTMPlus（TaKaRa）试剂说明书操作，用1.5%（质量分数）的琼脂糖凝胶电泳检测所提取RNA 的质量，利用NanoDrop 2 000 定量各个样品的RNA 浓度。以1 μg 总RNA 为 模 板，根 据Reverse Transcriptase MMLV（RNase H-）（TaKaRa）反转录试剂盒说明书，合成cDNA。运用Primer 3.0 软件设计LmE75D的特异性表达引物。每个样本作2 个技术重复，以βactin作为内参。利用软件Primer 3.0 设计特异性的表达引物，引物信息见表1。2-△Ct法分析LmE75D基因在每个组织与发育时间点的相对表达量，结果以平均数±标准差表示。采用Tukey’s HSD 进行显著性差异检验，柱形图上不同字母代表基因表达差异显著。

1.4 基于RNAi的LmE75功能分析

1.4.1 dsRNA的体外合成与注射

由于飞蝗4个E75亚型N端A/B域核苷酸相似度较高，LmE75A 和LmE75B 以及LmE75C 的A/B 域核苷酸一致度为45.0%和47.7%，LmE75B 和LmE75C的A/B 域核苷酸一致度为64.1%，LmE75D和其他亚型相比仅在N 端A/B 域核苷酸差异60 bp，无法设计特异的有效dsRNA 进行RNAi 实验，因此我们选择了4 个LmE75 亚型共同区域设计dsRNA 以全部沉默4个LmE75 转录本，研究LmE75 在飞蝗中的生物学功能。根据4 个飞蝗LmE75亚型基因共同区域的核苷酸序列，在E-RNAi（http：//www.dkfz.de/signaling/e-rnai3/idseq.php）网站设计dsRNA 引物，引物信息见表1。以稀释后的LmE75和GFP 质粒DNA分别为模板进行PCR 扩增以获得用于体外转录dsRNA 的模板，按照2×Taq PCR MasterMix（TIANGEN）说明书进行PCR 反应体系的配置及反应程序的设置。PCR产物的回收纯化按照FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit（Vazyme）说明书操作，之后用1.5%（质量分数）的琼脂糖凝胶电泳检测扩增条带的单一性。利用纯化后的DNA 产物为模板，参照T7 RiboMAXTMExpress RNAi System（Promega）试剂盒说明书步骤分别合成LmE75和GFP基因的dsRNA，利用NanoDrop 2 000定量各个样品的dsRNA浓度和纯度。用ddH2O 将合成的dsRNA 稀释至终浓度为2 μg/μL，置于－80 ℃冰箱保存备用。挑取N4D1 的若虫进行dsRNA 注射，同时注射dsGFP作为对照组。每头10 μg，设置3 个生物学重复，每个重复15 头若虫。注射完毕后，将所有试虫放置于养虫室内饲养。

表1 本文所用引物Table 1 Primers used in this study

1.4.2 沉默效率检测及表型观察

注射dsRNA 48 h 后分别收集对照组dsGFP和处理组dsLmE75的飞蝗第2－3 体节体壁提取RNA，反转录为cDNA，采用RT-qPCR 方法检测LmE75的沉默效果，每组设置3 个重复，3 头试虫为1 个重复，并做2 个技术重复，操作与1.4 的检测方法相同，其余试虫用来观察表型。

1.4.3 体壁HE染色及透射电镜观察

解剖对照组N4D5（脊线开裂时）和处理组蜕皮前死亡和蜕皮困难死亡的飞蝗第2－3 体节体壁组织制作显微切片。用3%（体积分数）戊二醛固定，一部分4 ℃过夜以制备石蜡切片，另一部分剥离旧表皮后，将新表皮送至青岛医科大学制备电镜样品。用于制备体壁HE 染色的样品，步骤包括：1）不同浓度的酒精梯度脱水；2）不同比例的二甲苯和酒精进行透明，之后浸蜡及包埋；3）切片后，依次用苏木精和伊红两种染液染色；4）中性树脂封片后，常温保存备用，利用Olympus BX51 显微镜观察表皮结构。HE 染色的详细步骤参照文献［18］。用于电镜制备的样品，步骤包括：1）戊二醛固定后，放入1%（体积分数）的四氧化锇中3 h；2）不同浓度丙酮梯度脱水后，用Epon812 渗透；3）半薄切片定位分析，1%（体积分数）甲苯胺蓝染色；4）制备超薄切片，图片用JEM-1200EX 透射电子显微镜采集，详细步骤参照文献［19］。

2 结果

2.1 LmE75D基因序列特性分析

将搜索获得的1 个LmE75基因cDNA 序列命名为LmE75D（GeneBank 登 录 号 为MN584735），LmE75D的cDNA 序列其ORF 长度为1 971 bp，编码656 个氨基酸；Smart 预测LmE75D核受体结构域。结果表明：LmE75D A/B 域缺失、C 域（DBD）缺失、含有部分D域、完整的E域（LBD）和F域（图1），使用ExPaSy预测蛋白分子量以及等电点，LmE75D 的相对分子量为71.44 kDa，其pI为碱性7.64。SignalP分析LmE75D蛋白没有信号肽。综合比较LmE75 4 个亚型的核苷酸差异仅在N端（图2A），LmE75D和其他亚型相比仅在N 端A/B 域核苷酸差异60 bp；蛋白结构分析发现，LmE75A、LmE75B 和LmE75C 亚型具有典型的核受体结构域：A/B 域、C 域（DBD）、D 域、E 域（LBD）和F域，而LmE75D 亚型A/B域缺失、C域（DBD）缺失、含有部分D 域、完整的E 域（LBD）和F 域（图2B），4 个亚型的LBD 结构域与其他昆虫的LBD 结构域具有高度一致性，其中DBD 结构域包含两个锌指区域，每一个具有4 个半胱氨酸残基。LBD结构域中包含4 个参与血红素结合的重要氨基酸残基（图2C）。

图1 飞蝗LmE75D 序列分析下划线所示为配体结合域；小三角所示为与血红素结合的重要氨基酸残基Fig. 1 Sequence analysis of LmE75D in L. migratoria LBD underlined is the ligand binding domain（LBD）；Small triangles show important amino acid residues that bind to heme

图2 飞蝗LmE75 各亚型的生物信息学分析A：4 个LmE75 亚型N 端核苷酸序列比对；B：4 个LmE75 亚型结构域分析；C：LmE75 亚型氨基酸序列与马铃薯甲虫和德国小蠊E75 多重比对. 在序列的上方标记DNA 结合域（DNA-binding domain）铰链域（Hinge domain）配体结合域（Ligand-binding domain）。序列下方的圆圈指示锌指中的四个Cys 残基，三角形标记参与血红素结合的重要氨基酸残基Fig. 2 Bioinformatics analysis of LmE75 isoformsA：Nucleotide alignment of the A/B domain of three LmE75 isoforms；B：Domain structure analysis of the LmE75 nuclear receptor isoforms；C：Multiple alignments of LmE75 isoforms with E75 of L. decemlineata and B. germanica The DNA-binding domain，hinge domain and ligand-binding domain are tagged above the sequence. The zinc binding site，the DNA binding site，the ligand binding site and the core regulatory site are labeled below the sequence，the circle indicates that there are four Cys residues in the zinc finger，and the important amino acid residues involved in heme binding are marked with triangles

2.2 LmE75D时空表达特性分析

RT-qPCR 检测LmE75D在不同组织中的表达发现，LmE75D在马氏管、体壁、前肠和后肠中表达量较高，而在卵巢中表达量最低（图3A）。进一步分析LmE75D在体壁4 龄第1－5 天（N4D1-N4D5）以及5 龄第1－7 天（N5D1-N5D7）的表达模式显示，LmE75D在4 龄和5 龄若虫每一天均衡表达（图3B）。

图3 飞蝗LmE75D 基因的时空表达（A）：AN：触角；FG：前肠；GC：胃盲囊；MG：中肠；HG：后肠；FB：脂肪体；MT：马氏管；SP：精巢；OV：卵巢；MU：肌肉；WP：翅；IN：体壁；BR：脑（B）：N4D1-N4D5 代表四龄第1-5 天，N5D1-N5D7 代表五龄第1-7 天，Fig. 3 Spatio-temporal expression of LmE75D in L. migratoria（A）：AN：Antennae；FG：Foregut；GC：Gastric caeca；MG：Midgut；HG：Hindgut；FB：Fat body；MT：Malpighian tubules；SP：Sperm；OV：Ovary；MU：Muscle；WP：Wing；IN：Integument；BR：Brain（B）：N4D1-N4D5 represent day 1 to 5 of the 4th instar nymphs，N5D1-N5D7 represent day 1 to 7 of the 5th instar nymphs

2.3 基于RNAi的LmE75生物功能分析

2.3.1LmE75沉默效率检测及表型观察

RT-qPCR 的结果表明，相比对照组，注射dsLmE75D的飞蝗其LmE75基因的表达被显著抑制（图4A）。当对照组飞蝗5 天蜕皮发育为5 龄若虫时，注射dsLmE75的飞蝗67.5%脊线未开裂于蜕皮前死亡，32.5%脊线开裂蜕皮失败死亡（图4B）。

图4 注射dsLmE75 后基因表达以及表型分析Fig. 4 Gene expression and phenotypic analysis of L. migratoria after injected with dsLmE75

2.3.2 干扰LmE75后体壁H＆E 染色和透射电镜观察

体壁HE 染色的结果显示，与对照组相似，注射dsLmE75D组可以正常发生皮层溶离，并且有新表皮合成和旧表皮降解过程（图5A）。透射电镜结果显示，相比对照组，注射dsLmE75组的新表皮厚度明显降低，对照组新表皮的层状结构有明显的16层，而注射dsLmE75组的新表皮层状结构有12 层，相比对照减少4 层（图5B）。

图5 注射dsLmE75 后体壁HE 染色和透射电镜TEM 分析Fig.5 HE staining and TEM analysis after injected with dsLmE75

3 讨论

本研究基于飞蝗的转录组数据库，搜索获得E75 的亚型LmE75D，开放阅读框全长为1 971 bp，编码656 个氨基酸。在黑腹果蝇D. melanogaster［15］、家蚕［12］、德 国小蠊［11］、褐 飞虱Nilaparvata lugens［20］、赤拟谷盗［10］和马铃薯甲虫［13］等昆虫中也发现E75 具有不同数量的亚型，如马铃薯甲虫中有3个E75 亚型［13］，黑腹果蝇有4 个E75 亚型［15］，德国小蠊 有5 个E75 亚 型［11］。飞 蝗 有4 个E75 不 同 亚 型，LmE75A、LmE75B和LmE75C具有完整的一个非依赖配体的激活结构域（A/B 结构域）、DNA 结合域（C 结构域）、铰链连接域（D 结构域）、配体结构域（E 结构域）和F 结构域，而LmE75D 结构域分析显示A/B 域缺失、C 域（DBD）缺失、含有部分D 域、完整的E 域（LBD）和F 域。类似结果在德国小蠊中也有报道，如BgE75B 亚型含有部分DBD 和完整LBD，BgE75D 亚型缺失DBD 含有完整LBD［11］。果蝇E75 是血红素传感器，位于LBD 结构域的血红素中心能与双原子分子（CO 或NO）结合［21］，和果蝇相似，飞蝗也含有4 个参与血红素结合的重要氨基酸残基。

本研究采用RT-qPCR 对LmE75D在不同组织以及发育时期的表达进行了分析，结果表明LmE75D在体壁、前肠、中肠等多个组织中表达。E75 基因的多组织分布特性在家蚕［12］、黑腹果蝇［15］、烟草天蛾［4］和马铃薯甲虫［13］中也有报道，但不同昆虫E75亚型的表达特性有所不同，如马铃薯甲虫中3 个E75 均在体壁低表达，而在马氏管、中肠、腹神经节、脑-心侧体-咽侧体复合体等多个组织高表达［13］。LmE75D在4－5 龄每一天均衡表达，这 一 表 达 模 式 与20E 滴 度［18］没 有 正 相 关，推 测LmE75D的表达可能不受20E 的调控。 这与LmE75A、LmE75B和LmE75C的 表 达 模 式 不 同，LmE75A和LmE75B在4 龄和5 龄期均在蜕皮中表达量最高，蜕皮前后表达量均较低，LmE75C在4 龄和5 龄期蜕皮前表达量最高。家蚕B. mori中3 个E75 亚型也表现出不同的发育表达模式［12］，而在马铃薯甲虫中，3 个E75 亚型具有相似的发育表达特性［13］，表明不同昆虫E75转录本在不同龄期可能发挥着不同的功能从而共同完成E75的功能。

目前仅在黑腹果蝇［15］、德国小蠊［11］和褐飞虱［20］中报道了E75 各亚型的功能，结果均发现E75 亚型功能存在冗余现象，如德国小蠊不同转录本RNAi均能下调各自靶基因的表达量，但其他转录本上调，最终没有可见表型出现。由于飞蝗4 个E75 亚型N 端A/B 域核苷酸相似度较高，LmE75A 和LmE75B 以及LmE75C 的A/B 域核苷酸一致度为45.0%和47.7%，LmE75B 和LmE75C 的A/B 域核苷酸一致度为64.1%，LmE75D 和其他亚型相比仅在N 端A/B 域核苷酸差异60 bp，无法设计特异的有效dsRNA 进行RNAi 实验，因此我们选择了4 个LmE75 亚型共同区域，设计dsRNA 以全部沉默4 个LmE75 转录本研究LmE75 在飞蝗中的生物学功能。注射dsLmE75至4 龄若虫后，LmE75的表达较对照组显著降低，当对照组飞蝗蜕皮发育为5 龄若虫时，注射dsLmE75的飞蝗分别以蜕皮前死亡和蜕皮中致死两种形式达到100%死亡率。进一步对体壁进行HE 染色和透射电镜分析发现，注射dsLmE75组的若虫，新表皮形成较对照组显著减少。这与5 龄期LmE75RNAi 结果不同，注射dsLmE75至五龄第1 天后飞蝗出现发育延迟现象，死亡率达100%，且体壁无皮层溶离现象。虫体承受dsRNA 的能力不同，可能导致4 龄注射和5 龄注射dsLmE75后表型的差异。类似结果在赤拟谷盗中也有报道，当在幼虫阶段沉默TcE75后，一部分幼虫在蜕皮时死亡，另一些幼虫在静息阶段死亡［10］。而在德国小蠊中，注射BgE75的六龄若虫可存活长达80 天，最终不能蜕皮为成虫而死亡［11］。以上研究表明E75功能在昆虫中是保守的。