油樟叶纯露成分分析及不同季节纯露的抑菌活性研究

吴芳 杨立艳 李莉 黄彭 魏琴

摘要 以不同季节（春季、夏季、秋季、冬季）宜宾油樟叶片为研究对象制备纯露，利用GC-MS对油樟纯露的主要成分进行分析，通过抑菌圈、最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC），研究不同季节纯露对大肠埃希氏菌 （E.coli）、福氏志贺氏菌（S.flexneri）、金黄色葡萄球菌（S.aureus）和肠炎沙门氏菌（S.enteritidis） 的抑菌活性。结果表明，油樟叶纯露中的主要组分为1，8-桉叶油素（57.86%）、α-松油醇（31.74%）和松油烯-4-醇（9.13%）;不同季节纯露对4种供试微生物均有明显的抑菌效果，以冬季纯露效果最好;4种供试微生物中，对金黄色葡萄球菌抑制效果最好。油樟纯露作为油樟精油生产副产物，具有一定的开发潜力。

关键词 油樟;纯露;GC-MS;抑菌活性;不同季节

中图分类号 R 285  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2021）16-0190-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.16.051   开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Hydrosol Composition and Antibacterial Activity of  Cinnamomum longepaniculatum  （Gamble） Leaves from Different Seasons

WU Fang1，2，YANG Li-yan1，3，LI Li1，2 et al （1.Sichuan Oil Camphor Engineering Technology Research Center，Yibin，Sichuan 644000;2.Department of Quality Management and Inspection and Testing，Yibin University，Yibin，Sichuan 644000;3.Key Lab of Aromatic Plant Resources Exploitation and Utilization in Sichuan Higher Education，Yibin University，Yibin，Sichuan 644000）

Abstract The leaves of  Cinnamomum longepaniculatum  in different seasons （spring，summer，autumn，winter） were used as the research object to prepare pure dew.The main components of  Cinnamomum longepaniculatum  were analyzed by GC-MS.Through the zone of inhibition，minimum inhibitory concentration （MIC） and minimum bactericidal concentration （MBC），the antibacterial activity of pure dew in different seasons on  E.coli，S.flexneri，S.aureus  and  S.enteritidis  were studied.The results indicated the major metabolites including 1，8-cineole（57.86%），α-terpineol （31.74%） and Terpinene-4-ol （9.13%）.The pure dew in different seasons had obvious antibacterial effect on the 4 tested microorganisms，and the pure dew in winter had the best effect.Among the 4 tested microorganisms，the inhibitory effect on  Staphylococcus aureus  was the best.As a by-product of essential oil of  Cinnamomum longepaniculatum  production，hydrosol had a certain development potential.

Key words  Cinnamomum longepaniculatum; Pure dew;GC-MS;Antibacterial activity;Different seasons

純露是水蒸气蒸馏制取精油时的副产物，其气味较精油柔和，对哺乳动物毒性低，在化妆品行业得到越来越广泛的应用，另外，由于其抗菌和抗氧化性能，在食品工业中应用也越来越受到青睐。油樟[ Cinnamomum longepaniculatum  （Gamble） N.Chao ex H.W.Li]是中国四川宜宾的特有资源树种，生长在海拔600～2 000 m的常绿阔叶林中[1-2]，其叶片被广泛用于制取油樟精油。油樟油具有抗菌[3-5]、消炎[2]和抗氧化[6-7]等活性，主要用于出口香料和药品的原料，其主要成分为桉树油素（cineole）、松油醇（terpineol）和桧烯（sabinene）等[4]。但在利用水蒸气蒸馏制取精油的过程中，不可避免地会得到许多“蒸馏水”（经冷凝即为纯露），目前常被作为油樟精油生产的废弃物被排放掉。纯露在化妆品行业和食品工业中都有很好的利用，为了充分利用森林资源，有必要对油樟精油生产过程中的“纯露”利用潜力进行研究。精油和纯露的主要成分是挥发性有机物，Li等[4]对油樟精油的化学成分及其抑菌活性进行了研究，与精油一样，油樟纯露可能也含有抗菌成分，具有利用价值（如玫瑰纯露，售价很高），但有关油樟精油生产副产物纯露的研究鲜见报道。

该研究以不同季节（春季、夏季、秋季、冬季）宜宾油樟叶片为研究对象制备纯露，利用GC-MS对油樟纯露的主要成分进行分析，通过抑菌圈、最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC），研究不同季节纯露对大肠埃希氏菌 （E.coli）、福氏志贺氏菌（S.flexneri）、金黄色葡萄球菌（S.aureus）和肠炎沙门氏菌（S.enteritidis） 的抑菌活性，旨在评估油樟纯露在作为油樟精油生产副产物开发方面的应用潜力。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试油樟叶采自四川省宜宾市高县红岩山（27°50′N、105°20′E），包括1份多株叶片的混合样品（用于分析油樟叶纯露化学成分组成），1株植株春季、夏季、秋季、冬季不同季节叶片的样品（用于分析不同季节油樟叶纯露主要化学成分差异）。供试菌种为大肠埃希氏菌 （E.coli  ATCC 21534）、福氏志贺氏菌 （S.flexneri  ATCC 21513）、金黄色葡萄球菌 （S.aureus  ATCC 21530）和肠炎沙门氏菌 （S.enteritidis   21600），菌种购自中国微生物菌种保藏中心。细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基，真菌采用PDA培养基。

1.2 研究方法

1.2.1 纯露的制取。参照Tabti等[8]方法并略加改进。材料经蒸馏水洗涤后自然晾干，剪碎后称取50 g（3个重复），放入4 ℃冰箱备用。制备时利用旋蒸仪，50 g样品加入400 mL蒸馏水放入1 L蒸馏瓶中，煮沸后转小火保持微沸6 h，冷却1 h后收集上层油樟花水，4 ℃冰箱中贮存备用。

1.2.2 纯露成分的测定。采用美国安捷伦Agilent 7890B/5975C气质联用仪（GC-MS）对试样成分进行分析。

1.2.2.1 色谱条件。色谱柱为DB-FFAP （60 m×250 μm×0.25 μm）;载气为氦气（He）;流速1.0  mL/min;柱温：程序升温 90～190 ℃（5 ℃/min），恒温5 min，190～220 ℃（5 ℃/min），恒温 3  min，220～250 ℃（5 ℃/min）;进样量 0.5 μL。

1.2.2.2 质谱条件。分流模式进样，分流比 3∶1;进样口温度230 ℃;离子源温度230 ℃;四极杆150 ℃;电离方式为EI;电子能量70 eV;电子倍增管电压1 847 V;扫描质量范围30～550 amu。数据分析用Agilent 公司GC-MS solution工作站，NIST 08美国标准数据库。

1.2.3 抑菌活性测定。参考抗菌盘药敏试验性能标准[9]，采用纸片扩散法，有改动。定性滤纸制作成直径6 mm 的圆形纸片，高压灭菌后分2份，分别浸泡于纯露和无菌蒸馏水中浸泡2 h备用。吸取菌浓度106～107 CFU/mL的上述4种致病菌各100 μL分别用涂布棒均匀涂布到固体培养基表面，再将滤纸片放置在含菌平板上，每个纸片相隔一定间距，每种菌设3个重复，并设空白对照（一个平板呈三角形放置3 张滤纸片），倒置于培养箱中恒温培养（37 ℃、24 h）。测量抑菌圈的直径，计算真实抑菌直径。计算公式如下：真实抑菌圈直径（mm）=试验组抑菌圈直径-对照组抑菌圈直径。

1.2.4 最低抑菌浓度（MIC）。参照魏琴等[10]的方法进行。按照纯露和蒸馏水1∶1～1∶16的比例进行稀释，然后各取0.5 mL 加入装有9 mL培养基的试管中，再加入0.5 mL供试菌的菌悬液，使纯露在培养基中的浓度分别为0.75、0.375、0.187 5、0.093 75、0.046 875 mL/mL，充分振荡混匀，使试管中的细菌浓度达到105 CFU/mL。每个试验均设置3个重复。观察试验结果，若试管出现浑浊，则有菌生长，从而确定MIC。

1.2.5 最小杀菌浓度（MBC）。参照张萍等[11]的方法。取浑浊前的澄清菌悬液0.1 mL涂布于LB固体培养中，在细菌培养箱中培养24 h。试验均设置3个重复。记录试验结果，将最后一个没长菌培养基所对应的稀释浓度确定为最低杀菌浓度（MBC）。

2 结果与分析

2.1 油樟叶纯露成分及含量

混合叶片制备纯露的GC-MS图谱如图1所示，该试验条件下共鉴定出17个化合物（表1）。相对含量由数据处理系统根据峰面积归一法给出。油樟叶纯露中的主要组分为1，8-桉叶油素（57.86%）、α-松油醇（31.74%）和松油烯-4-醇（9.13%），其主成分含量与Li等[4]研究所得的油樟精油主成分（1，8-桉叶油素58.55%、α-松油醇15.43%和松油烯-4-醇4.84%）较类似。为分析不同季节油樟纯露中主要成分的差异，利用GC-MS分析不同季节油樟纯露，并将3种主要组分相对含量统计于表1。

2.2 不同季节纯露的抑菌活性

从表2可以看出，油樟叶纯露对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、福氏志贺氏菌和肠炎沙门氏菌均有抑制作用，抑菌效果冬季最强、春季最弱。

2.3 不同季节纯露对细菌的MIC和MBC

从表3可以看出，根据纯露的MIC值，不同季节纯露的抑菌效果不同，春季：金黄色葡萄球菌>肠炎沙门氏菌=大肠埃希氏菌=福氏志贺氏菌;夏季：金黄色葡萄球菌>大肠埃希氏菌>肠炎沙门氏菌=福氏志贺氏菌;秋季：金黄色葡萄球菌=福氏志贺氏菌>大肠埃希氏菌=肠炎沙门氏菌;冬季：金黄色葡萄球菌=福氏志贺氏菌>肠炎沙门氏菌=大肠埃希氏菌。根据纯露的MBC值，不同季节纯露的杀菌效果不同，春季：金黄色葡萄球菌>肠炎沙门氏菌=大肠埃希氏菌=福氏志贺氏菌;夏季：金黄色葡萄球菌>大肠埃希氏菌>肠炎沙门氏菌=福氏志贺氏菌;秋季：福氏志贺氏菌=大肠埃希氏菌>金黄色葡萄球菌=肠炎沙门氏菌;冬季：金黄色葡萄球菌=福氏志贺氏菌>肠炎沙门氏菌=大肠埃希氏菌。总体上看，不同季节纯露对4种供试菌均有抑制和杀菌效果，相對而言，对金黄色葡萄球菌的抑制和杀菌效果较好，对肠炎沙门氏菌效果相对较差。

3 结论

（1）不同季节油樟叶纯露的化学成分中相对含量较高的组分有3个，分别为1，8-桉叶油素、α-松油醇和松油烯-4-醇。

（2）从抑菌圈的大小来看，冬季的油樟纯露对4种供试病菌的抑制效果最好，其中对金黄色葡萄球菌抑制效果最为强烈，抑菌圈达5.6 mm。其他季节的抑菌效果依次是夏季纯露、秋季纯露和春季纯露，除了秋季纯露对福氏志贺氏菌的效果最好外，其余3个季节纯露均对金黄色葡萄球菌的抑制效果最好。

（3）从MIC和MBC值来看，冬季纯露的抑菌和杀菌效果均最好，其次为夏季、秋季和春季。不同季节纯露均对金黄色葡萄球菌的抑制效果最好。

参考文献

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