黑皮鸡枞的分子鉴定与营养需求研究

罗影 关永强 贾培松 赵振豪 努尔孜亚?亚力买买提 魏鹏 贾文捷

摘要 为了明确黑皮鸡枞的营养需求，促进其制种工艺的提高。以新疆麦盖提县人工栽培的菌株为试材，采用单因素试验分别对其母种和原种的营养需求进行试验。结果显示，黑皮鸡枞母种培养基中最佳碳源为麦芽糖，最佳氮源为酵母浸粉，加入1%的MgSO4、CaCl2及枣粉均能促进其菌丝生长，而NaCl和KH2PO4抑制其菌丝生长，菌丝培养最适温度为20～28  ℃，最适pH为5.5～6.0;原种培养基中将棉籽壳与木屑以7∶3比例混合作为主料使用效果明显。

关键词 黑皮鸡枞;ITS;营养需求

中图分类号 S 646  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2021）16-0044-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.16.013   开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Study of Molecular Identification and Nutritional Requirement of  Hymenopellis raphanipes

LUO Ying1，GUAN Yong-qiang2，JIA Pei-song1 et al （1.Institute of Plant Protection， Xinjiang Academy of Agricultural Sciences， Urumqi，Xinjiang  830091; 2.Xinjiang Institute of  Chinese Materia Medica and Ethnodrug，  Urumqi， Xinjiang  830002 ）

Abstract To identify the effects of different nutrients on the mycelical growth of  Hymenopellis raphanipes，  and improve the level of strains production.The test was studied by single factor plate experiment， using a  Hymenopellis raphanipes  strain from Maigaiti County of Xinjiang as material.The results showed that the best carbon and nitrogen source were maltose and yeast extract respectively.The addition of 1% MgSO4， CaCl2 and jujube powder could promote the mycelial growth， while NaCl and KH2PO4 inhibited it.The optimal temperature range  was 20-28 ℃， and the optimal pH was 5.5-6.0.The mixture of cottonseed hull and sawdust at the ratio of 7∶3 was used as the main material.

Key words  Hymenopellis raphanipes; ITS;Nutritional requirement

黑皮雞枞 （Hymenopellis raphanipes）， 又名二孢拟奥德蘑[1]、卵孢小奥德赛蘑、长根菇、长寿菇[2-3]，是新近商业化栽培的热门食用菌。其在分类学上属担子门（Basidiomycota）、伞菌纲（Agaricomycetes）、伞菌目（Agaricales）、膨瑚菌（Physalacriaceae）[2]。该菌曾一度误认为是长根小奥德赛蘑 （Oudemansiella radicata）、鳞柄小奥德赛蘑（Oudemansiella furfuracea）及鸡枞菌（Termitomyces albuminosus） [4]。Hao等[4]基于ITS和LSU片段的分子系统学分析将该菌认定为 Oudemansiella raphanipes，分类学研究中把其划归为Hymenopellis 属[5]。但由于我 国Oudemansiella raphanipes首次报道卵孢小奥德赛蘑时拉丁文名为Oudemansiella raphanipes， 所以为避免学名混乱，国内一部分研究一直使用该名[6]。

黑皮鸡枞香味馥郁，肉质鲜嫩，含有丰富的氨基酸、蛋白质、多糖及矿物质元素等营养成分[7]，并具有较高的药用价值，具有健脾益气、止痛消肿等功效[3， 8]，是一种珍稀食药用真菌。目前对于黑皮鸡枞的研究，也涉及多个方面，包括子实体营养成分[7，9]、 化学成分及生物活性分析[8]，原生质体的制备[10]，液体培养基优化[3]及实际栽培中各项指标的研究[11-12]等。

我国黑皮鸡枞的人工栽培史相对较短，2007年人工栽培成功[13]，后续又不断对栽培技术进行优化，已实现规模化周年栽培[14]，目前山东、北京、四川、广州、江苏等地均有一定规模的人工栽培。随着西部大开发和精准扶贫的开展，黑皮鸡枞也在新疆有小规模的栽培，但栽培面积小、产量少、质量不稳定，产品远远不能满足市场的需求。其中菌种是制约黑皮鸡枞产业发展的因素之一。笔者对麦盖提县栽培的黑皮鸡枞子实体进行组织分离，为防止出现同种异名的情况，对采集的黑皮鸡枞进行ITS序列测定，明确种源，并对其母种和原种的营养需求进行研究，为黑皮鸡枞的制种工艺提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株。黑皮鸡枞菌株（JZ004）保藏于新疆农业科学院植物保护研究所，其子实体采集于喀什地区麦盖提县人工栽培菇房。

1.1.2 培养基。PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH自然;基础培养基：葡萄糖20 g，蛋白胨3 g，琼脂20 g，pH自然;基础代料配方：主料78%，麦麸20%，石膏1%，石灰1%。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种的分离与纯化。

采用组织分离法进行分离纯化，选择菇盖肥厚、无病虫害的子实体作为分离材料，先将采集的子实体用无菌水清洗表面，再用75%乙醇表面消毒，在菌盖与菌柄交接处取0.3～0.4 cm3的组织，移放到PDA斜面培养基中央，置于25  ℃恒温培养箱内培养，定期观察菌丝生长情况，待菌丝长至1/2板时，挑取菌落边缘新生菌丝转接至PDA培养基平板，连续转接3次即可得到纯化菌株，纯化好的菌株接种至PDA培养基斜面，待菌丝长满斜面置于4 ℃保藏箱保藏，每个菌株保存5支。

1.2.2 菌种的活化与菌丝体收集。

将低温保藏的黑皮鸡枞菌种接种到PDA平板培养基上，25 ℃恒温黑暗培养，待菌丝长满平板备用。活化后，取菌丝尖端再接于PDA平板，培养基表面铺一层玻璃纸。固体培养的菌丝体，用灭菌的接种铲沿着玻璃纸的表面将菌丝体轻轻刮下，置称量纸上，天平称量备用。

1.2.3 ITS序列测定。

采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒（天根生化科技有限公司）进行总DNA的提取，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量和浓度。

采用通用引物 ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG和 ITS4 TCCTCCGCTTATTGGATATGC（由生工生物工程股份有限公司合成）进行PCR扩增。PCR反应体系（25 μL）：2× Taq  PCR MasterMix 12.5 μL，引物（10 μmol/L）各1.0 μL、模板1.0 μL，无菌双蒸水补足至25 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，72 ℃修复延伸10 min。PCR扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

将PCR产物交于生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。测序结果提交至NCBI核酸数据库（www.ncbi.nlm.nih.gov/），进行BLAST比对分析。选取同源性较高的序列进行系统进化分析，利用MEGA 6.0软件首先进行多重序列比对，再采用Neighbour-joining法构建系统发育树，进行1 000次Bootstrap自举法检验。

1.2.4 母种培养基优化

1.2.4.1 平板试验法。每个平皿中央定量接种直径5 mm的菌丝块，25 ℃恒温黑暗培养，主要以菌丝生长速度为指标，同时观察菌落的形态特征、菌丝长势等，所有试验均采用90 mm的培养皿，培养基用量20 mL/皿。

1.2.4.2 培养基成分对黑皮鸡枞菌丝生长的影响。

采用平板试验法，分别固定基础培养基上的碳源和氮源含量，对碳源、氮源及无机盐进行单因素试验，以基础培养基为对照，恒温暗培养，每个处理5个重复，综合考虑菌丝长势和菌丝生长速度，研究不同培养基成分对黑皮鸡枞菌丝生长的影响。

1.2.4.3 培养条件对黑皮鸡枞菌丝生长的影响。采用平板试验法，使用PDA培养基，分别改变温度（5～30 ℃）、pH（4.0～8.5）进行单因素试验，每个处理5个重复，综合考虑菌丝长势和菌丝生长速度，研究不同培养条件对黑皮鸡枞菌丝生长的影响。

1.2.5 原种培养基优化

1.2.5.1 平板筛选。

选择食用菌栽培中常用的15种培养料，磨成粉末，过筛，在PDA培养基基础上添加等量培养料，每个处理5个重复，筛选適合黑皮鸡枞培养的培养料。

1.2.5.2 代料配方筛选。根据平板筛选结果，设计多个代料培养基配方，通过培养试验，对比不同培养基配方下黑皮鸡枞菌丝体生长速度和菌丝长势等生物学指标，筛选出适宜代料培养基配方。

2 结果与分析

2.1  ITS序列 将测序结果在NCBI上进行BLAST可知，供试菌株与GenBank数据库中卵孢小奥德赛蘑 （Hymenopellis raphanipes） 的ITS序列同源性大于99%。选取10个同源性较高的序列，以口蘑科口蘑属松茸  （Tricholoma matsutake  EU294302.1） 的ITS为外群，与JZ004一起，用MEGA7.0中Neighbor-joining 法（maximum likehood bootstrap trials=1 000），构建系统发育树，结果见图1。结果显示，供试菌株种源明确，与 Hymenopellis raphanipes 聚为一簇，从分子水平上鉴定采集的样本为卵孢小奥德赛蘑（ Hymenopellis raphanipes）。

2.2 母种培养基优化

2.2.1 培养基成分筛选

2.2.1.1 碳源。

由表1和图2可知，黑皮鸡枞在8种碳源培养基上均能生长，但在不同碳源培养基上，菌丝生长有较大差异。以单一无机碳源培养黑皮鸡枞时，其菌丝长势较差。以可溶性淀粉为碳源时，菌丝生长速度最快，但菌丝长势较差，以麦芽糖为碳源时，菌丝生长速度达（5.81±0.84） mm/d，与对照和其他6种碳源存在显著差异，且菌丝长势最好，综合菌丝长势和生长速度，菌株JZ004 的最佳碳源为麦芽糖。

2.2.1.2 氮源。

由表2和图3可知，黑皮鸡枞在11种氮源培养基上均能生长，包括有机氮、氨基酸、无机氮化合物等，且不添加氮源时也能生长，但在不同氮源培养基上，菌丝生长有较大差异。其中以有机氮为氮源时菌丝相对浓密，菌丝长势较好，且以酵母膏为氮源时，菌丝最为浓密粗壮，其次是酵母浸粉、牛肉膏、酸水解酪蛋白，以酵母浸粉为氮源时，生长速度最快，达（5.52±0.39）mm/d，牛肉膏和酸水解酪蛋白为氮源时次之。综合菌丝长势和生长速度，最佳氮源为酵母浸粉。

2.2.1.3 无机盐。

由图4可知，不同无机盐对黑皮鸡枞菌丝生长的影响效果有明显差异。基础培养基中加入MgSO4，在供试范围内均能促进其菌丝生长，加入CaCl2，低浓度对黑皮鸡枞菌丝生长起促进作用，后随着浓度升高，又表现出抑制作用，且二者在加入量为1%，其促进作用均最明显;而NaCl和KH2PO4在供试范围内均起到抑制作用。

2.2.1.4 枣粉比例。

新疆当地红枣资源丰富，以PDA培养基为基础培养基，加入不同比例的枣粉，通过培养试验，分析不同比例下黑皮鸡枞菌丝体生长速度和菌丝长势等生物学指标，筛选出适宜的母种培养基配方。结果显示，菌株JZ004加入1%枣粉时，菌丝长速最快，且菌丝长势较好（表3、图5）。

2.2.2 培养条件筛选。

2.2.2.1 温度。设计多个培养温度，通过培养试验，分析不同温度下黑皮鸡枞菌丝体生长速度和菌丝长势等生物学指标，筛选出黑皮鸡枞适宜生长的温度。结果显示，菌株JZ004在15～30 ℃均能生长，在5和35 ℃条件下，菌丝能萌发但不能吃料和生长。在20～28 ℃菌丝生长均较好，长速差异不显著（表4、图6）;结合图3，黑皮鸡枞为中高温型菌株，菌丝在20～28 ℃均适合其生长。

2.2.2.2 pH。改变培养基pH，通过培养试验，分析不同pH处理下黑皮鸡枞的菌丝生长速度和菌丝长势等生物学指标，筛选出黑皮鸡枞适宜生长的pH。结果显示，黑皮鸡枞菌丝在pH为4.5～9均可生长，且改变培养基pH菌丝长势差异不显著。以菌丝长势为评价指标，黑皮鸡枞菌丝最适生长的pH在5.5～6.0，偏酸，差异显著（表5）。

2.3 原种培养基筛选

2.3.1 平板筛选。

选择食用菌栽培种常用的15种培养料，磨成粉末，过筛，在PDA培养基基础上添加等量培养料，每个处理5个重复，筛选适合黑皮鸡枞培养的培养料。结果显示，PDA培养基中加入培养料粉末，菌株JZ004的菌丝密度和生长速度均有所增强，其中加入未发酵棉籽壳时，生长速度最快，差异显著（表6、图7）。

2.3.2 代料筛选。

根据平板筛选试验，棉籽壳、木屑、玉米芯等均可以作为代料栽培黑皮鸡枞。按照比例将棉籽壳和木屑混合作为主料，采用栽培袋进行试验。结果见表7，主料为棉籽壳∶木屑7∶3比例混合时，菌株JZ004在栽培袋中生长速度最快，且菌丝浓白，因此，棉籽壳与木屑以7∶3比例混合可作为主料。

按照比例将以7∶3比例混合的棉籽壳与木屑，再与玉米芯进行混合，进行培养基主料筛选，结果见表8。主料加入玉米芯后，对黑皮鸡枞生长速度影响差异不显著，但总体上是不加入玉米芯的培养料中菌株JZ004菌丝生长相对较快。

3 结论与讨论

黑皮鸡枞作为一种营养价值丰富的食用菌，栽培前景广阔，也是近年来比较热门的商业化栽培食用菌。在新疆也有小规模的栽培，但存在产量少、质量不稳定、人工成本高等问题，产品远远不能满足当地市场的需求。其中菌种是制约黑皮鸡枞产业发展的因素之一。该研究以麦盖提县栽培的黑皮鸡枞子实体进行组织分离的菌株为试材，对其进行ITS序列测定，以明确其种源，然后对其母种和原种的营养需求进行研究，以期为黑皮鸡枞的制种工艺提供理论依据，为新疆黑皮鸡枞的产业化发展提供技术支持。

该试验结果表明，供试菌株种源明确， 与Hymenopellis raphanipes 聚为一簇，从分子水平上鉴定采集的样本为卵孢小奥德赛 蘑（Hymenopellis raphanipes）。 综合菌丝长势和生长速度，黑皮鸡枞菌丝生长的最佳碳源为麦芽糖，最佳氮源为酵母浸粉，加入1%的MgSO4、CaCl2及枣粉均能促进其菌丝生长，而NaCl和KH2PO4抑制其菌丝生长，菌丝培养最适温度为20～28 ℃，最适pH为5.5～6.0;原种培养基中棉籽壳、木屑、玉米芯等均可以作为代料栽培黑皮鸡枞，其中将棉籽壳与木屑以7∶3比例混合作为主料使用效果最佳。

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