围生期孕妇B族链球菌筛查方法学探讨及血清型耐药性分析

王 林，段雯婷，樊清清，王 维

陕西省西安市第一医院：1.检验科；2.心血管内科；3.药剂科，陕西西安 710002；4.陕西省西安市儿童医院检验科，陕西西安 710003

B族链球菌(GBS)，又称无乳链球菌，是一种常见的革兰阳性球菌，在直肠和阴道中正常寄居，属条件致病菌，一般健康人群感染GBS并不致病[1-2]。GBS是导致围生期孕妇和新生儿普遍感染的致病菌，除可引起孕妇产褥感染、胎膜早破、胎儿早产、流产外，孕妇在分娩中也可能将此菌传递给新生儿，导致新生儿肺炎、脑膜炎、败血症，甚至死亡[3-4]。因此，早期筛查GBS并有针对性地运用抗菌药物对围生期孕妇和新生儿至关重要[5]。本研究选取2018年1月至2020年8月于西安市第一医院就诊的874例围生期孕妇作为研究对象，对GBS感染的菌株筛查方法、血清型、耐药性及孕妇临床结局进行分析，为更准确、快速鉴定GBS及合理运用抗菌药物提供依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取西安市第一医院2018年1月至2020年8月产科门诊及住院收治的35～37周孕妇874例为研究对象。纳入标准：所有孕妇1周内未使用抗菌药物[6]；患者及其家属对本研究均知情同意。孕妇年龄22～41岁，平均(26.9±2.2)岁。用无菌拭子于生殖道低位1/3处，沿阴道壁轻轻旋转取孕妇生殖道拭子标本，于肛门括约肌以上2～5 cm处沿肠壁轻轻旋转取直肠拭子标本，得到标本后立即送检。

1.2仪器与试剂 实验仪器包括抗州安杰思科技有限公司AFD9600荧光定量PCR仪，德国布鲁克MALDI-TOF基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪，法国梅里埃VITEK2-Compact全自动细菌鉴定及药敏分析仪，CO2培养箱。试剂材料包括GBS PCR检测试剂盒[博尔诚(北京)科技有限公司]，GBS筛查培养基(郑州安图生物工程股份有限公司)，GBS血清分型试剂(丹麦国立血清研究所)，VITEK2 配套药敏卡GP67[最低抑菌浓度(MIC)法，法国梅里埃公司]。

1.3方法

1.3.1GBS鉴定 (1)显色培养加鉴定法。将生殖道和直肠分泌物标本分别接种于GBS显色平板，并分区画线，35 ℃、5% CO2培养箱内培养24 h，挑取浅粉色至红色可疑菌落采用MALDI-TOF基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪及VITEK2 Compact全自动细菌鉴定及药敏分析仪进行分析鉴定。如果24 h未见典型菌落，可延长培养时间至48 h。(2)荧光定量PCR法。用生理盐水将生殖道和直肠分泌物标本洗脱混匀，根据试剂盒说明书提取细菌DNA，制作PCR检测模板。

1.3.2血清型鉴定 采用乳胶凝集法，按照试剂说明书对 GBS菌株进行血清型鉴定，30 s内记录结果。

1.3.3药敏试验 将阳性菌落稀释至0.5麦氏单位，采用上机MIC法，经VITEK2 Compact全自动细菌鉴定及药敏分析仪对青霉素、左氧氟沙星、替加环素、头孢曲松、四环素、氨苄西林、万古霉素、红霉素、利奈唑胺、克林霉素、头孢吡肟进行药敏试验。

2 结 果

2.1显色培养加鉴定法和荧光定量PCR法阳性检出率比较 显色培养加鉴定法耗时24 h，阳性检出率为6.41%(56/874)；荧光定量PCR法耗时4 h，阳性检出率为8.92%(78/874)。两者阳性检出率比较，差异有统计学意义(P=0.048)。

2.2孕妇临床结局分析 874例孕妇中有33例发生胎儿窘迫、孕妇败血症、新生儿败血症、早产、胎膜早破等异常情况，其中28例经荧光定量PCR法检测GBS为阳性,19例经显色培养法检测GBS为阳性，差异有统计学意义(P=0.014)。

2.3孕妇定植GBS菌株的血清型分布 78株孕妇定植的GBS共检出4种血清型，分别为Ⅲ型(40株，51.28%)、Ⅰb型(16株，20.51%)、Ⅰa型 (13株，16.67%)、Ⅴ型(9株，11.54%)。

2.4药敏试验结果 33株阳性分离株药敏试验结果显示，GBS对万古霉素、利奈唑胺、替加环素、头孢吡肟、头孢曲松、氨苄西林、青霉素、四环素敏感性较高，对克林霉素、左氧氟沙星、红霉素敏感性较低。见表1。

表1 GBS阳性分离株的药敏试验结果(%)

2.5GBS耐药性与血清型的相关性 克林霉素、左氧氟沙星耐药性与血清型差异有统计学意义(P<0.05)，血清型Ⅲ、Ⅰb、Ⅴ型耐药性较高。见表2。

表2 GBS耐药性与血清分型的相关性

3 讨 论

GBS寄生于健康人下消化道与泌尿生殖道中，为条件致病菌，现已证实GBS是造成围生期母婴感染的主要致病菌之一[7-8]。美国疾病预防控制中心(CDC)制定的围生期GBS防治指南指出，在妊娠末期进行GBS筛查，对阳性患者采取积极预防和治疗措施可有效降低GBS感染[9-10]。

GBS筛查方式包括显色培养法、荧光定量PCR法、免疫法等。显色培养法是诊断GBS的常规方法，但需24～48 h，耗时较长，同时易出现假阴性结果。GBS筛查培养基加入了显色底物，经24 h培养，若长出浅粉色至红色菌落，说明有GBS生长，容易辨别。荧光定量PCR法检测GBS灵敏度高，特异度强，重复性好，耗时短，操作方便，但对实验人员和设备要求较高。本研究对874例35～37周孕妇直肠-生殖道拭子标本分别应用GBS显色培养加鉴定法(MALDI-TOF基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪及VITEK2 Compact全自动细菌鉴定及药敏分析仪)和荧光定量PCR法检测GBS。结果显示，显色培养加鉴定法耗时24 h，阳性检出率为6.41%，而荧光定量PCR法仅耗时4 h，阳性检出率为8.92%，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)，荧光定量PCR法优势明显,此结果与国内其他研究结果一致[11-12]。对此次接受检查的孕妇进行追踪统计显示，33例发生异常情况的孕妇，28例经荧光定量PCR法检测GBS为阳性，19例经显色培养加鉴定法检测GBS为阳性，差异有统计学意义(P<0.05)，说明荧光定量PCR法GBS检出阳性符合率高于显色培养及鉴定法。

本研究结果显示，孕妇所定植的GBS共检出4种血清型，分别为Ⅲ型(51.5%)、Ⅰb型(21.2%)、Ⅰa型 (15.2%)、Ⅴ型(12.12%)，比例与其他文献报道的GBS血清分型有差异[13]，提示GBS分布存在地域差异。针对GBS感染的孕妇，临床上多根据经验使用青霉素、氨苄西林等进行预防治疗，对青霉素过敏的患者，则使用克林霉素、红霉素治疗。近年来随着抗菌药物的大量使用，耐药株逐渐增多[14-15]。本研究药敏试验结果显示，GBS对万古霉素、利奈唑胺、替加环素、头孢吡肟、头孢曲松、氨苄西林、青霉素、四环素敏感性较高，分别为100.00%、100.00%、100.00%、100.00%、100.00%、100.00%、100.00%、82.05%，对克林霉素、左氧氟沙星、红霉素敏感性较低，分别为50.00%、50.00%、0.00%，此结果与其他地区GBS药敏结果报道略有不同[16-17]，提示感染的GBS菌株在不同地区存在差异性。因此，对于围生期孕妇GBS感染者，应根据药敏试验结果及时调整治疗方案，以提高治愈率。据文献报道，GBS耐药性与其血清分型、含有耐药基因等因素密切相关[18]，本研究结果显示，Ⅲ、Ⅰb、Ⅴ型3种血清型耐药性较广泛，与Ⅰa型差异有统计学意义(P<0.05)，可能是GBS产生耐药性的主要原因。

综上所述，围生期孕妇感染GBS的风险较高，临床应重视围生期孕妇GBS筛查，本研究样本量有限，不同地区GBS的血清型、耐药性均可能存在差异，实验室应根据自身情况选择最优的检测方法。临床应根据药敏结果合理选用抗菌药物，以提高治疗的安全性和有效性，改善孕妇妊娠结局。