基于SSR标记评价江西赣东北茶树遗传多样性

蔡 翔，胡桂萍，王礼献，杨普香

江西省蚕桑茶叶研究所/江西省茶叶质量与安全控制重点实验室，江西 南昌 330202

江西省茶产业历史悠久，种质资源丰富，茶叶品质优良，据资料统计已有地方品种多达三百个，主要分布于赣中北、赣西北、赣中和赣南区域[1]，如婺源县已记载的地方品种就有86个。但截至目前，江西省茶叶地理标志产品只有4个，为狗牯脑茶、庐山云雾茶、瑶里嫩蕊和婺源绿茶[2]。究其原因，主要是茶树资源收集与保藏等工作底子薄、起步晚，茶树资源遗传评价也未形成全面信息，直接影响了地方优良茶树品种的开发和利用。

现有研究表明植物资源遗传评价主要通过形态学水平、细胞学水平、生理生化水平和DNA分子水平[3]，但主要以DNA分子水平分析遗传多样性居多。常用的分子标记技术有SSR、AFLP、ISSR，RFLP和SNP等，其中SSR标记技术比较成熟，具有操作简单、稳定性好、高度重复性和多态性好等优点，已经在水稻[4-5]、菜心[6]及大豆[7-8]等农作物的研究中应用广泛，也在茶树遗传多样性分析中得到大范围应用[9-10]。如王丽鸳等[11]利用SSR分子标记技术分析了西湖龙井群体的91个单株的遗传多样性；王旭等[12]基于33对SSR引物标记分析了84个茶树品种的遗传多样性。但对江西茶树种质资源遗传多样性方面的研究鲜见报道，尤其是利用SSR标记分析江西茶树种质资源多样性未见报道。

茶树品种是茶产业发展的基础，近年来江西茶产业受到高度重视，进行茶树品种选育已成为当前江西茶产业发展的主要研究方向。本研究拟采用SSR标记对江西赣东北茶树种质资源进行遗传多样性分析，以期为江西茶树新品种的改良、培育和评价等提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

参试的17个茶树样品（表1）采自江西省蚕桑茶叶研究所，春季采摘无病虫害感染的新叶，存于-70℃冰箱中，放入冰箱前用液氮迅速冷冻，后续试验备用。

表1 样品编号、名称及原产地Table 1 Number, name and origin of samples

1.2 DNA的提取

基因组DNA提取的方法参考黄建安等[13]改进的CTAB法，其完整性用浓度为2%琼脂糖凝胶电泳检测，NanoDrop 2000超微量分光光度计检测DNA的浓度和纯度（OD260 /280比值），并稀释至20 ng/μL保存于-20℃冰箱，用于后续PCR扩增。

1.3 SSR引物合成

随机选择40条SSR引物，SSR引物参照杨阳等[14]、Fang等[15]和Ma等[16]引物序列，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。选用上梅州、大面白、楮叶齐、福鼎大白、凤凰水仙、赣茶2号6份不同省份和差异较大的基因组DNA对上述合成引物进行多态性筛选，选择多态性丰富、重复性好、条带清晰的核心引物进行资源的多样性分析。

荧光标记引物（FAM）（5'-CACGACGTTGT AAAACGAC-3'），统一在正向引物（L）的5'端加上与荧光标记引物（FAM）一样的序（CACGACGTTGTAAAACGAC）（表2），均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表2 9对SSR引物及其序列Table 2 Nine pairs of SSR primers and their sequences

1.4 PCR扩增和产物鉴定

PCR扩增在热循环仪（ABI Veriti 96）上进行，PCR扩增反应总体积为10 μL：其中包括5 μL 2×TaqPCRMasterMix（包含dNTPs, Taq聚合酶 , MgCl2等）、0.1 μL 10 μmol的 M13-tailed 正向引物、0.3 μL 10 μmol的荧光标记引物（FAM）、0.4 μL 10 μmol的反向引物、2 μL DNA 模板和2.2 μLddH2O。PCR扩增反应程序为：94℃，4 min；10个循环：94℃，45 s；63℃，30 s；72℃，30 s；25个循环：94℃，45 s；53℃，30 s；72℃，30 s；72℃，10 min，4℃保存。扩增产物寄到上海派森诺生物科技有限公司进行毛细管凝胶电泳，所用仪器为ABI 3700xl DNA Analyzers （Applied Biosystems, 美国），使用GS-500LIZ （Applied Biosystems, 美国）作为内标。

1.5 数据处理

采用人工读带的方法，以分子量大小按照A、B、C、D等依次记录目标条带内清晰的条带。利用POPGENE软件分析不同引物在17个茶树品种中扩增的等位基因数（Observed number of alleles, Na）、有效等位基因（Effective of alleles, Ne）、观测杂合度（Observed heterozygosity, Ho）、期望杂合度（Expected heterozygosity, He） 及 Shannon信息指数（Shannon’s informationindex, I）。通过PowerMarker分析主要等位基因频率（Majorallele frequency）、基因型数（Genotype）和多态性信息量（polymorphisminformation content, PIC），再计算17个品种间的Nei’s遗传距离，基于Nei’s遗传距离构建 Neighbor-Joining（NJ）系统进化树，进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 茶树资源的SSR多态性

40对SSR引物在6份资源中共筛选到9对扩增多态性较好的核心引物（表2）。9对引物在17份资源中的扩增情况见表3，共扩增出32个等位基因（Na），每对引物最多扩增5个，最少的2个；有效等位基因（Ne）平均值为2.89，变异范围为1.49 ～ 3.98；共检测到52个基因型，其范围在3 ～ 10个；引物的观测杂合度（Ho）为0.06（TM83） ～ 0.94（TM49）；期望杂合度（He）最大值为0.79（TM107），最小值为0.34（TM83）,平均值为0.62；Shannon信息指数（I）为0.51 ～ 1.49 ，平均值为1.08；多态性信息含量（PIC）变异范围为0.31 ～ 0.73，平均值为0.54，其中PIC值最高的是引物TM107。PIC≥0.50的引物有6个，占多态性引物总数的2/3，表明总体上这些引物多态性情况良好。

表3 17个参试茶树品种SSR标记的扩增结果Table 3 Amplification information of SSR markers in 17 tested tea cultivars

2.2 茶树品种亲缘关系分析

根据筛选出的9对多态性引物扩增谱带，分析等位基因出现频率，并根据其计算Nei's遗传距离，结果发现17个茶树品种的遗传距离在0.14 ～ 0.78，其中铅山群体D和婺茶8号之间的遗传距离最大，铅山群体A和江茶97号、铅山群体B和铅山群体C的遗传距离最小（表4）。

表4 参试茶树品种间的Nei's遗传距离Table 4 Nei's genetic distance among the tested tea cultivars

基于Nei's遗传距离，采用NJ法绘制17个品种的聚类图（图1）。当D = 0.19时，17个茶树品种基本可以分成4类，第Ⅰ类包括江茶97号和婺茶1号等9个茶树品种，4个铅山群体样品和天柱山乡群体都聚到了一起，但是同样来自铅山的桐木关群体和道士坑群体是聚类在第Ⅱ类，说明来源于同一地方相同的品种不完全都是亲缘关系较近；第Ⅱ类包含铅山县武夷山镇西坑乡桐木关群体、铅山县武夷山镇西坑乡道士坑群体、赣茶2号和婺源6号4个品种；第Ⅲ类包含江茶3号、婺茶14号和浮梁群体3个品种；第Ⅳ类仅有一个品种婺茶8号。

图1 基于Nei's遗传距离茶树品种的聚类Figure 1 Neighbor-Joining dendrogram of 17 tested tea cultivars based on Nei's genetic distance

3 讨论

为了准确评估江西东北茶树资源的遗传多样性，本研究选用不同省份的6个国家级茶树良种，经过PCR扩增与谱带分析，筛选出了多态性丰富且稳定的核心引物9对，每对引物的等位位点数都小于5或者等于5，平均值为3.56。本实验扩增产物寄到上海派森诺生物科技有限公司进行毛细管凝胶电泳检测，较之前使用的琼脂糖凝胶电泳具有更高效、分辨率更高等优点。毛细管凝胶电泳检测可以显示扩增产物片段的大小，对产物检测的准确性更高，实现了数据处理的自动化[17]。毛细管电泳技术检测SSR荧光标记扩增产物已有报道运用于茶树品种的多样性分析上[18]。

参试的17个样品都产自江西省赣东北。其中铅山群体A、铅山群体B、铅山群体C、铅山群体D、天柱山乡群体、道士坑群体和桐木关群体原产地是铅山；婺茶1号、婺茶8号、婺茶14号、婺源6号、江茶3号、江茶97号、江茶94号和赣茶2号原产地是婺源；浮梁广明和浮梁群体原产地是景德镇。赣茶2号是国家级品种，原名鄣科1号，由江西省婺源县茶叶科学研究所从福鼎大白茶与婺源种自然杂交后代中选育出来的。从聚类图可以看出，赣茶2号与婺源6号、桐木关群体和道士坑群体样品聚为一类，表现出较近的亲缘关系，因此原产地婺源的婺源6号与赣茶2号可能有着相同或相近的亲本 。

从SSR多态性分析结果来看，多态性信息含量（PIC）变化范围较大，在0.31 ～ 0.73；基于Nei’s遗传距离茶树品种的聚类图得出同一县城的茶树品种并不完全聚类到一类，说明相似环境选育的茶树品种，由于异花授粉和长期的引种驯化，使得群体资源的遗传背景复杂，江西省赣东北茶树种质资源具有相对丰富的遗传多样性。