基于根域灌溉系统的柑橘黄龙病生物防治研究*

何鹏搏，李咏梅，刘宏斌，范世达，王金振，孙致远，李远航，彭 磊，王云月，李 琦

（1 云南农业大学植物保护学院，昆明650201）（2 云南农业大学机电工程学院）（3 云南农业大学园林园艺学院）（4 云南省玉溪市华宁县柑橘产业发展办公室）

柑橘黄龙病（citrus Huanglongbing）是一种严重影响柑橘产业的细菌性病害[1]，其病原菌主要由柑橘木虱和嫁接传播，可侵染宽皮橘类、柚、金橘、橙等重要经济水果[2]，尚无有效的商业化抗病品种和化学药剂可防治[3]。目前中国已经有300 多个县报道有黄龙病发生。江西省赣州市自2013 年黄龙病暴发以来，砍了5 000 万株柑橘树，严重影响柑橘产业的发展[4]。玉溪市柑橘种植面积达到1.47 万hm2，占玉溪市水果种植面积的1/3 以上[5]，其中华宁县是重要的山地产区[6]，也是柑橘黄龙病病区[7]。

生物防治是一种环境友好型的病害防治方式，近些年来很受重视[8]。芽孢杆菌属的细菌广泛应用于植物病害的生物防治[9]，其中枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）L1-21 是一株分离自柑橘叶片的内生细菌[10]，可防治柑橘黄龙病[11]。华宁县柑橘的灌溉方式以微喷灌溉为主，本研究将根域灌溉技术与生物防治的方式结合，以期给柑橘黄龙病的田间防治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地点在云南省玉溪市华宁县华溪镇斑茅棵亚热带水果示范园内，地理坐标在北纬24°06′，东经103°02′，海拔1 223 m，年日照时数2 190 h，年平均气温19.5 ℃，无霜期350 d，年平均空气相对湿度70%～80%，该地区分雨季和旱季，平均年降水量930 mm，6—10 月为雨季，降水主要集中在6—8 月，11 月至次年5 月长达7个月的时间为旱季。试验地土壤透水性强、保水性差，属沙砾土壤。

1.2 根域灌溉系统设计

1.2.1 试验设计与处理

2014 年开始，作者团队在上述示范园内构建了水肥药一体根域精准自动灌溉系统[12]，以2 年生蜜柑‘新津’幼树为试材，开始根域灌溉技术与微喷灌溉技术研究与试验，建立了对比研究试验基地，根域灌溉试验地面积0.67 hm2，微喷灌溉试验地面积0.33 hm2。试验地共有1 447 株柑橘树，依据控制浇水、施肥、施药的电磁阀分成8个不同区域，其中2号阀区域有柑橘树120 株、8号阀192 株，均随机标记5 株病树为生防菌处理区，7号阀区域有柑橘树240 株，随机标记5 株树为不用生防菌对照区，相邻微喷灌溉地块（人工开关阀）有柑橘树480株，其中1 行有15 株树，选取5 株为空白对照。2017 年试验地与对照地均开始试挂果，采果时发现疑似黄龙病病果及病树，大部分集中在2、7、8号阀控制区域，标记取样检测确诊后，于2018 年开始根部施用生防菌剂的黄龙病治疗试验。

1.2.2 生防菌剂的施用

从2018 年3 月1 日开始用菌，每月1 次，一直延续至2020 年2 月，共24 次。枯草芽孢杆菌L1-21 由云南农业大学植物保护学院植物病害生防实验室分离，由云南省微生物发酵工程研究中心生产。稀释300 倍，菌浓度为3×107cfu/mL，每次每株树施菌液5 L。于2018 年5 月9 日和2019 年5月27 日抽取柑橘叶片，用于黄龙病菌含量检测。

1.3 试验方法

1.3.1 黄龙病菌含量检测

取6 片柑橘叶片，清水洗净，使用CTAB 法[13]提取叶中脉的DNA，采用实时荧光定量PCR（Realtime Quantitative PCR，qPCR）法检测柑橘黄龙病拷贝数，方法参照文献［14］。所用引物为CQULA04F/CQULA04R（5′-TGGAGGTGTAAAAGTTGCCAAA-3′/5′-CCAACGAAAAGATCAGATATTCCTCTA-3′），由上海捷瑞生物工程有限公司合成。TB Green Premix Ex Taq Ⅱ由 TaKaRa 公司。仪器为StepOnePlus Real-Time PCR System（Thermo Fiser Scientific）。反应体系为：TB Green Premix ExTaq Ⅱ12.5 μL，引物CQULA04F/CQULA04R 各0.8 μL（10 μmol/L），去离子水5.9 μL，DNA 溶液5 μL（约100 ng），总体积25 μL。扩增程序为：95 ℃预变性1 min；95 ℃变性15 s，59 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，45个循环。每个DNA 样品3 次重复。做标准曲线得到回归方程：Y＝（33.934－X）/3.275，其中X为qPCR 反应后的CT 值，Y为DNA 模板溶液的Lg 值。DNA 模板溶液的DNA 来自m（叶中脉质量，g）且溶于100 μL 去离子水，所以黄龙病菌含量＝（10Y×100）/m。

病原菌下降率（%）＝［（处理前病原菌含量－处理后病原菌含量）/处理前病原菌含量］×100

校正防效（%）＝［（处理组病原菌下降率－空白对照组下降率）/（1－空白对照组下降率）］×100

1.3.2 柑橘果实品质的测定

测定了柑橘果实可溶性固形物、维生素C、还原糖和总酸4个指标。其中还原糖含量测定方法参照国家标准GB 5009.7—2016。可溶性固形物含量测定方法参照中华人民共和国农业行业标准NY/T 2637—2014。总酸含量测定方法参照国家标准GB/T 12456—2008。维生素C 含量测定方法参照国家标准GB 5009.86—2016。每株树3 次重复。

2 结果与分析

2.1 1 年后防治效果

由表1 可知，采用根域灌溉1 年后，同一株柑橘树的黄龙病病菌含量均下降，但是施菌液处理（8号阀）的柑橘黄龙病病菌含量下降幅度最大，平均下降率为98.39%，校正防效为86.29%；未施菌液处理（7号阀）和对照的黄龙病病菌平均下降率为96.36%、88.25%，可见生防菌剂对黄龙病病菌有一定的抑制作用。对照的黄龙病病菌含量也在下降，原因是施用生防菌剂枯草芽孢杆菌L1-21 后，该菌株在同一个区域里向四周扩散，借风雨覆瓦状传播，导致未直接处理的相邻植株黄龙病菌亦减少。

表1 1 年内柑橘黄龙病病菌含量对比

2.2 生防菌对柑橘果实品质的影响

2018 年9 月、2019 年9 月和2020 年10 月测定了各处理果实品质相关指标。结果表明（表2），施菌液后（2号阀、8号阀）的果实可溶性固形物、维生素C、还原糖、总酸含量均未受到影响。然而，由于内生枯草芽孢杆菌L1-21 在田间扩散的原因，导致各处理植株果实品质没有明显差异。

表2 1 年内柑橘果实品质各指标对比

3 讨论与结论

在以年为单位的时间里，黄龙病病菌含量是随着时间的变化而变化的[13]，但施菌液处理（8号阀）的柑橘黄龙病病菌含量下降幅度大于未施菌液处理（7号阀），说明生防菌剂对减少黄龙病菌有明显的效果。在同一时期，施菌液处理（2号阀、8号阀）的柑橘树黄龙病病菌平均下降率大于对照，说明生防菌剂对黄龙病病菌有一定治疗作用。特别值得说明的是，柑橘树一旦患上黄龙病，就变成不可逆。在每年同一个季节里，植株体内的病菌数量不可能自动减少，病情只会逐年加重，病菌数量增多，从而造成病树逐年失去生产能力，最终死亡。

柑橘黄龙病在不同的寄主上，发病症状差异较大，又因其症状类似缺素症，且其病原菌不能培养，因此常用的病害诊断方法为PCR 检测和荧光定量检测[14]。其中荧光定量检测方法不仅灵敏度高，还可以对病原菌定量。本研究采用此方法测定病原菌含量，比较不同年份同一月份的病原菌含量，以病原菌下降率来计算防效，结果较为可靠。黄龙病为系统病害，根、茎、叶和果均可检出病原菌，但其含量不同[15]。Johnson 等[16]研究表明，黄龙病的病原侵染柑橘后，优先定殖于根部，根部就像一个病原菌库，源源不断地为新叶提供病原菌。因此柑橘黄龙病的防治，根部健康不容忽视。枯草芽孢杆菌L1-21 是柑橘内生菌，叶面喷施和灌根均可使其定殖在柑橘的根、茎、叶和果实内。施用L1-21 的柑橘园周围的东、南、西、北4个方向1 km 内均可检测到L1-21 定殖，并且定殖量较高[17]。此外，L1-21 还可定殖在柑橘园内的多种杂草里[10]，这些结果表明L1-21 可以离开植株寄主，借风雨传播开来，这就是为什么未施生防菌剂但是紧靠处理组的7号阀、对照的病原菌含量也下降的原因，而小路对面的对照组因为离处理组较远，其病原菌含量下降率低于7号阀。因此，以后的田间试验对照不能设在相邻地块，必须间隔1 km 以上。菌株L1-21 在田间的这种扩散特性有利于田间防治，即只是在部分植株或地块，特别是在上风口处施用菌剂，就能很好地减轻病害。L1-21 处理柑橘后，代谢组结果表明，寄主与抗病相关物质发生变化[11]，防治黄龙病可能的机制为诱导抗病性，但其机制尚未十分明确。

柑橘黄龙病可影响果实品质和造成减产，果实症状为“红鼻子果”[18]。本试验田因L1-21 的扩散，所有植株均未出现“红鼻子果”。本研究中生防菌对柑橘果实品质4 项指标影响不明显，也可能与该菌株扩散有关。

目前尚无有效的商业化抗病品种和化学药剂防治黄龙病，常用防治方法为采取微量元素补给、控制传播载体柑橘木虱来阻断传播和砍伐发病植株[19]。微量元素补给在病害较轻时可在一定程度上保证柑橘产量，防治柑橘木虱重在预防，而砍树对于产量来说是毁灭性的。本研究结合微生物菌剂的生物防治方法，用机械灌溉的方法根施生防菌剂，以期为柑橘黄龙病的田间防治提供新思路。由于未做叶片、果实和根部的生防菌检测，植株体内有多少生防菌在发挥作用，还有待于进一步检测验证。