IL-23 Th17细胞在布鲁杆菌性脊柱炎中的作用研究

贾永利， 左宪宏， 杨新明， 张培楠， 孟宪勇， 胡长波

(1.河北北方学院附属第一医院骨外科， 河北 张家口 075000 2.张家口学院， 河北 张家口 075000)

布鲁杆菌病是一种全球常见的细菌性人畜共患病，能够影响多种器官和组织，引起一系列临床表现[1]。骨关节受累是布鲁杆菌最常见的并发症，发生率为10%-85%，而布鲁杆菌性脊柱炎(BS)是较为严重的并发症[2]。BS临床表现复杂，鉴别诊断难度较大，极易发生误诊、误治，从而延误治疗时机，导致病情反复发展，影响患者健康和正常生活[3]。了解BS发病相关机制可能为BS诊断和治疗提供理论基础。辅助性T细胞17(Th17)是一种来源于初始T细胞的CD4+T效应细胞亚群，通过分泌白细胞介素(IL)-17A、IL-22等细胞因子，促进炎症和自身免疫性疾病的发生发展[4]。研究表明，Th17细胞与布鲁杆菌病的免疫反应有关[5]。IL-23属于IL-12异源二聚体细胞因子家族，主要由巨噬细胞、活化的树突状细胞及单核细胞等产生，作用于Th17细胞，在免疫性疾病的发病中有重要的作用[6]。目前，对IL-23、Th17在BS发病中的作用尚不清楚，本研究通过分析BS患者IL-23、Th17的水平，探讨二者与BS发病的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料:选取2015年1月至2020年4月河北北方学院附属第一医院收治的111例BS患者为研究对象，其中男78例，女33例，年龄23～78岁，平均年龄(50.78±7.29)岁，其中70例患者有家畜饲养史或接触史，13例患者有食用生奶/未熟肉史，28例患者致病原因不明确。同期选取医院健康体检对象120例为对照组，其中男85例，女35例，年龄22～79岁，平均年龄(50.15±7.79)岁。两组受试者年龄、性别比较差异无统计学意义(P>0.05)。所有受试对象均签署知情同意书，本研究经河北北方学院附属第一医院伦理委员会批准通过。BS诊断符合《布鲁菌病诊疗专家共识》中的相关标准[7]，结合流行病学史、实验室检查及临床表现进行综合判断。纳入标准：①实验室检查证实布鲁杆菌感染(布鲁杆菌病依靠临床表现和实验室检查指标，其中实验室指标包括试管凝集试验，补体结合实验以及布病抗-人免疫球蛋白实验，并结合病原学检查)；②MRI检测证实有实质性脊柱损害；③治疗前患者未曾服用免疫功能药物、免疫调节剂、免疫抑制剂进行免疫治疗；④患者均住院接受抗生素治疗10d左右。排除标准：①其他可导致骨损害的疾病；②银屑病等其他自身免疫性疾病患者；③重大脏器功能不全者；④有慢性感染史患者；⑤合并恶性肿瘤患者。病程在6个月以内痊愈为急性期，超过6个月仍未痊愈为慢性期，其中急性期患者61例(急性期组)，慢性期患者50例(慢性期组)。

1.2主要试剂及仪器:淋巴细胞分离液(北京索莱宝科技有限公司，批号P9240)；佛波酯(PMA)、离子霉素、莫能霉素(美国sigma公司，批号P8139-1MG、P3011-4M、P5719-5J)；破膜剂(Fix/Perm)、固定剂/破膜剂(Perm/Wash)(美国BD公司，批号50-GAS037、70-GAS049)；鼠抗人CD3-FITC抗体、鼠抗人CD4-PE抗体、鼠抗人IL-17-PerCP抗体(武汉艾美捷科技有限公司，批号ANT-137、ANT-237、ANT-224)；IL-23、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-17、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(英国abcam公司，批号ab203719、ab601315、ab312297、ab561479、ab103572)；流式细胞仪(美国BD公司，型号FACSCanto)。

1.3方 法

1.3.1实验室指标检测:对BS患者治疗前血清试管凝集试验(SAT)滴度、C反应蛋白(CRP)、红细胞沉降率(ESR)水平进行检测。

1.3.2血液样本采集:对照组于体检当日清晨、BS患者于住院次日清晨治疗前抽取空腹静脉血6mL，其中3mL装至普通离心管中，4℃ 3000rpm离心5min，分离血清，-80℃冰箱保存备用。其余血液装至EDTA抗凝管中，立即用于流式细胞术检测。

1.3.3ELISA法检测血清细胞因子水平:对血清IL-23、TNF-α、IL-17、MMP-2、RANKL水平进行检测，实验操作严格按照说明书进行。

1.3.4外周血单个核细胞(PBMC)的分离:将采集的EDTA抗凝血与等体积PBS缓冲液混匀稀释；灭菌管中加入5mL淋巴细胞分离液，之后加入稀释好的EDTA抗凝血，1500rpm离心30min，梯度法分离PBMC。

1.3.5流式细胞术检测Th17细胞:取PBMC细胞悬液，PBS清洗2次，1500rpm离心5min，弃上清；震荡混匀后取200μL加入流式管中；依次加入PMA、离子霉素、莫能霉素，37℃、5%CO2孵育4h；收集细胞，1500rpm离心5min，弃上清；PBS重悬细胞；加入鼠抗人CD3-FITC、CD4-PE抗体，混匀，避光孵育20min；PBS清洗2次，弃上清；加入1mL Fix/Perm溶液，混匀，4℃遮光孵育30min；PBS清洗；加入1mL Perm/Wash溶液，4℃，1500rpm离心5min，弃上清；加入2mL Perm/Wash溶液，4℃，1500rpm离心5min，弃上清；加入80μL Perm/Wash溶液，10μL鼠抗人IL-17-PerCP抗体，混匀，4℃遮光孵育30min；PBS洗涤2次，弃上清；加入PBS重悬细胞，混匀后流式细胞仪检测Th17细胞。

2 结 果

2.1慢性期组和急性期组一般资料比较:与慢性期组比较，急性期组年龄、性别、流行病学史差异无统计学意义(P>0.05)；急性期组SAT滴度≥1∶100、CRP≥5mg/L、ESR≥20mm/h患者比例均高于慢性期组(P<0.05)。见表1。

2.2各组血清RANKL、MMP-2水平比较:与对照组比较，慢性期组、急性期组血清RANKL、MMP-2水平均升高(P<0.05)；与慢性期组比较，急性期组血清RANKL、MMP-2水平均升高(P<0.05)。见表2。

表2 各组血清RANKL MMP-2水平比较

2.3各组血清IL-23、Th17细胞及相关细胞因子水平比较:与对照组比较，慢性期组、急性期组Th17细胞、血清TNF-α、IL-17、IL-23水平均升高(P<0.05)；与慢性期组比较，急性期组Th17细胞、血清TNF-α、IL-17、IL-23水平均升高(P<0.05)。见表3。

表3 各组血清IL-23 Th17细胞及相关细胞因子水平

2.4BS患者血清IL-23与Th17细胞水平的相关性:BS患者血清IL-23与Th17细胞水平呈正相关(r=0.657，P=0.000)。见图1。

图1 BS患者血清IL-13与Th17细胞水平的相关性

2.5BS患者血清IL-23、Th17与RANKL、MMP-2的相关性:BS患者血清IL-23与RANKL、MMP-2水平呈正相关(P<0.05)，Th17细胞与RANKL、MMP-2水平也呈正相关(P<0.05)。见表4。

表4 BS患者血清IL-23 Th17细胞与RANKL MMP-2的相关性

3 讨 论

BS是布鲁杆菌病严重的并发症之一，主要是由于患者椎体、椎管、椎旁组织、间盘、韧带等受到布鲁杆菌侵袭，继而产生炎性反应、脓性反应等造成的感染性疾病。本研究急性期组SAT滴度≥1∶100、CRP≥5mg/L、ESR≥20mm/h患者比例均高于慢性期组，提示急性期BS患者较慢性期患者存在严重的免疫性反应。Th17细胞是一种CD4+T细胞，能够分泌IL-17、TNF-α等多种细胞因子，在多种宿主机制防御体制及炎症性疾病中发挥重要的作用[8]。本研究结果表明BS患者Th17细胞、血清IL-17、TNF-α水平高于对照组，且急性期BS患者高于慢性期患者，与韩丽红等[9]研究结果一致，提示Th17细胞、IL-17、TNF-α可能与BS发病有关。

成骨细胞是唯一参与骨沉积的骨细胞，破骨细胞是人体内主要的骨吸收细胞，布鲁杆菌能够抑制成骨细胞骨基质沉积，产生MMP，分泌细胞因子，导致骨基质的降解，同时布鲁杆菌能够增加破骨细胞活性，促进骨吸收[10]。RANKL能够刺激骨细胞分化，是骨细胞中的关键诱导因子，导致骨破坏[11]。布鲁杆菌能够促进骨细胞中RANKL表达的增加，从而诱导骨吸收和骨破坏[12]，引起脊柱炎等布鲁杆菌骨病的发生。本研究结果表明BS患者血清RANKL、MMP-2水平高于对照组，且急性期BS患者高于慢性期患者，提示布鲁杆菌可能对BS患者成骨细胞、破骨细胞有一定的影响。研究表明IL-17与RANKL的表达及活性有关，能够促进破骨细胞生成和骨吸收[13]。TNF-α是一种参与多种炎症反应的细胞因子，在骨代谢中起着重要作用，其不仅是骨吸收诱导因子，在RANKL条件下，还能诱导破骨细胞前体直接转化为成骨细胞[14]。本研究结果发现BS患者Th17细胞与RANKL、MMP-2呈正相关，提示Th17可能通过影响BS患者成骨细胞及破骨细胞进而参与BS的发病，具体机制有待进一步研究。

IL-23是一种异二聚体细胞因子，能够促进Th17细胞的增殖。本研究结果表明，与对照组比较，BS患者血清IL-23水平升高，且急性期BS患者高于慢性期患者，提示IL-23可能参与BS的发病。IL-23可以通过诱导IL-17A、IL-22等下游细胞因子作用于成骨细胞和破骨细胞，进而影响骨吸收与骨形成[15]。本研究相关性分析结果表明，BS患者血清IL-23水平与Th17细胞呈正相关，且IL-23与RANKL、MMP-2水平呈正相关，提示IL-23可能通过影响Th细胞的增殖进而促进IL-17、TNF-α等细胞因子的释放，影响成骨细胞及破骨细胞活性，从而在BS发病机制中发挥一定的作用。

综上所述，IL-23、Th17与BS的发生有关，可能是IL-23诱导Th17细胞分泌细胞因子参与布鲁杆菌引起的机体免疫病理损伤，进而引起BS的发生。然而本研究仅对不同分期的BS患者血清IL-23、Th17及相关细胞因子水平进行检测，具体机制有待进一步研究。