基于荧光法的明场海水叶绿素传感器设计∗

景 超曹 煊吴 宁

(齐鲁工业大学(山东省科学院)，山东省科学院海洋仪器仪表研究所，山东省海洋监测仪器装备技术重点实验室，国家海洋监测设备工程技术研究中心，山东 青岛 266001)

海水中叶绿素含量不仅可以用来描述浮游植物的现存量，且可以作为海水富营养化的指标，对预防“赤潮”“绿潮”等海洋灾害具有重要的意义。

目前海水中叶绿素的检测方法主要有群落计数法[1]、遥感卫星[2－5]、分光光度法[6－8]、高效液相色谱法[9－11]等。但是，群落计数法虽然准确但费时费力；遥感卫星只适合大范围、全天候监测；分光光度与液相色谱只适合在实验室中进行且实验繁琐复杂，不能满足叶绿素原位实时检测。因为荧光法具有较低检出限、检测灵敏度高、结构简单、适用于现场原位检测等优势，因此，荧光法[12－13]被广泛用于海水中叶绿素的检测研究。

目前，国外的叶绿素传感器主要有美国YSI公司的EXO2多参数传感器、HACH公司的HYDROLAB HL7多参数监测仪、英国Valeport公司Hyperion-C叶绿素a荧光计、德国TriOS公司MicroFlu-chl叶绿素a分析仪、日本Alex Electronics公司的AAQ171多参数传感器等。虽然国内对叶绿素传感器的研究取得了一些的进展[14－18]，但是大多数还处于实验室阶段，且试验性能与国外还有一定差距。

本设计利用正交数字锁相放大[19－21](DLIA)技术解决了环境光干扰的问题，实现了对微弱荧光信号的提取；采用460 nm波长LED照射海水中的浮游植物产生荧光，利用高精度光电二极管作为荧光信号的接收器件，减少了环境光干扰的问题；同时利用软件算法对温度与浊度进行校正，减少叶绿素浓度检测的影响，提高检测的精度。

1 传感器原理设计

1.1 叶绿素荧光检测原理

物质在在吸收可见光后，可以发射出不同波长的光，这就是荧光。荧光分析法指通过检测物质受到光照后发生的荧光变化，根据荧光变化量来推测反映物质特性的分析方法。在较弱的光强下，浮游植物的叶绿素荧光强度只与叶绿素的含量有关，因此可以通过测特定光强下的荧光强度来测量叶绿素的含量。叶绿素荧光强度特性满足比尔吸收定律[22]，相对荧光强度:

式中:ε为摩尔吸收系数，c为叶绿素浓度，b为样品光程，k为荧光仪器系数，φ为叶绿素荧光效率，I为激发光强。

由于本设计采用对数计算，对式(1)取对数得到:

当仪器与检测物质确定后，A、B、D皆为常数。因此，可以通过检测浮游植物的荧光强度来检测出浮游植物中叶绿素的浓度。

叶绿素a的激发－发射光谱如图1所示。由图1可以看出，当叶绿素的激发光波长为460 nm附近时，发射荧光光谱的范围在680 nm区域内具有波峰，因此本文设计采用460 nm波长的高亮度L470－02型LED作为激发光源，并在680 nm附近进行接收，利用中心波长为680 nm的窄带滤光片来保证接荧光激发效率和接收荧光强度的最大化。

图1 叶绿素a的激发－发射光谱

1.2 正交数字锁相放大器的原理

正交数字锁相放大器(DLIA)是基于互相关原理设计的一种微弱信号检测设备，可以从干扰极大的噪声中提取所需要的信号信息，能够抑制噪声，提高检测的灵敏度与信噪比。本设计采用正交DLIA实现对微弱荧光信号的提取。

正交DLIA的原理如图2所示，S(t)为参考信号，R(t)是待检测的信号，外界噪声为n(t)。假设参考信号R(t)为幅值为A，角频率为ω，初相为θ的正弦信号:

图2 正交数字锁相放大器原理图

S(t)是幅值为B，周期为T的方波信号:

由图2可得:

由式(4)和式(6)得到:

由于噪声信号与参考信号的不相关性，因此可以滤除掉噪声信号，再经过低通滤波之后，就可以滤除掉n>1的差频项以及所有的高频项，便得到所需的信号:

同理，可以得:

将式(8)和式(9)代入公式(10)，便可以计算出所检测信号的幅值与相位，从而得到检测信号的大小。

1.3 数字锁相放大器的设计

正交同步检波原理如图3所示，是对交流信号进行相敏检波的放大器。利用和被测信号有相同频率和相位关系的参考信号作为比较基准，只对被测信号本身和那些与参考信号同频(或者倍频)、同相的噪声分量有响应。因此，能抑制无用噪声，改善检测的信噪比，实现对微弱信号的检测。

图3 正交同步检波原理图

本文设计的数字正交锁相放大器采用了方波乘以方波的形式，相敏检测波形如图4所示。首先，STM32F103单片机内部产生1 kHz的方波调制信号，对光源进行调制，同时作为参考信号。通过光电二极管接收的荧光信号R(t)，经过I/V转换放大之后，分别于相位差为90°的方波信号S1(t)、S2(t)进行乘法(PSD)运算，即:

图4 数字相敏检测波形图

将得到的数据进行A/D采集和数字IIR和FIR混叠低通滤波后，送到STM32F103中进行处理，得到的直流信号，便是叶绿素a浓度的响应值，便得到了所检测到的数据。

2 传感器硬件设计

2.1 光路设计

光路系统结构图如图5所示。光路系统功能:系统控制驱动电路，驱动LED产生波长为460 nm的激发光调制信号，激发光穿过滤光片入射水体中，水体里的叶绿素受激发光照射产生荧光信号，除此之外，环境杂散光等外部干扰信号在此时引入。再经过荧光滤光片，滤除掉其他波长的信号，得到波长为680 nm荧光信号，高精度的光电二极管将接收到的荧光信号和干扰信号转换为电信号，进行检测，经过解调放大得到所需的荧光信号。

图5 光路系统结构示意图

为了确保叶绿素a的荧光激发效率与接收荧光强度的最优化，降低研发成本，利用Zemax光学仿真软件对光路进行了模拟和仿真，仿真结果如图6所示。结果表明当激发光路与检测光路夹角为45°时，荧光激发效率和接收效率最高。光学探头结构如图7所示，由蓝光LED、光电二极管、激发光源滤光片、荧光滤光片等组成。

图6 光路仿真模拟

图7 光学探头结构

2.2 电路系统设计

电路系统由LED驱动电路、I/V转换电路、二级放大电路、AD采集电路、信号处理电路、电刷驱动和温度检测电路等组成。其中信号处理电路是整个电路的核心部分，电路系统的设计图如图8所示。

图8 电路系统设计图

选用STM32F103作为系统的主控芯片，主要包括通信模块与信号处理模块。STM32F103通过定时器产生一个1 kHz的方波调制信号，实现对激发光源LED调制；利用恒流源驱动芯片MAX1916驱动LED，避免了外界光的干扰，保证了激发光源LED的稳定性；通过高精度S2386－18L光电二极管接收荧光信号，提高检测灵敏度，降低噪声；通过ADC功能实现对信号的采集，在STM32F103中进行相敏检测与数字滤波，对数据进行的处理；传感器通过RS485与上位机进行通信，主控模块通过SPI、GPIO等形式与外设进行通信连接和数据交换。

I/V转换电路通过AD8630运算放大器实现。由于光电二极管产生的电流信号极其微弱，并受到外部噪声的干扰，故设计电阻R1为1 MΩ，实现对电流信号的放大；电容C1实现通交隔直作用，屏蔽部分直流信号，电容C2保证输出的稳定性，使电路更加稳定。放大的信号连接至LF442，二次放大对电压信号进行补偿和反向，实现对微弱荧光信号的检测。I/V转换与放大电路如图9所示。

图9 I/V转换与放大电路

温度和浊度会影响对水体中叶绿素含量的检测[23]。为了减少温度对叶绿素检测的影响，本文设计了温度监控系统，利用热敏电阻监测水温变化，通过温度建立数学模型，并利用软件算法进行温度补偿；此外，在光电检测装置前安装了荧光滤光片，以防止光电二极管检测到被反射或折射的激励光信号，然后使用偏最小二乘法建立数学模型进行校正，改善检测精度。

为防止生物附着在光学镜头表面，影响检测的效果，光学叶绿素传感器采用机械电刷的方式对光学镜头进行清洁。电刷驱动电路如图10所示，利用抗干扰能力强的电流驱动芯片L9110控制和驱动电机的运行，控制着电机正转和反转清除掉附着的在光学镜头表面的水生生物，延长在位时间。

图10 电刷驱动电路

2.3 传感器机械结构设计

本文设计的光学叶绿素传感器内部机械结构和传感器实物图如图11所示。仪器主要分为五个模块，包括信号检测模块、荧光探头、温度探头、清洁电刷、机械外壳等组成。

图11 传感器内部机械结构与实物图

信号检测模块由控制板A和控制板B组成。LED驱动电路、电刷控制电路以及电源供电电路组成控制板A；信号处理电路作为控制板B。将控制板A和信号处理电路隔离开，可以有效避免电源不稳定、温度漂移导致信号处理不稳定等缺点，提高检测的准确性。

传感器的内部结构设计合理、简洁高效，方便安装与固定，使传感器更加适用于海水中叶绿素的检测。

3 实验结果

3.1 动态测量范围

在实验室中，配置浓度梯度为:0.5μg/L、5μg/L、25μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L的叶绿素标准溶液和空白(0μg/L)溶液。实验时，利用光学叶绿素传感器去检测不同浓度溶液的A/D值，每组浓度的电压采样15次却平均值得到检测数据。将数据线性拟合，得到的叶绿素浓度曲线如图12所示，得到的线性回归方程为:y＝0.000 8x＋0.056 1，R2＝0.999 6，结果表明，在动态测量范围内(0～200μg/L)该传感器具有良好线性关系。

图12 传感器响应测试结果

3.2 传感器的检出限和精密度

为了检验该传感器的性能，以人工海水为基础，连续检测空白溶液7次，计算标准偏差(SD)，并以3SD作为传感器的检出限，由表1可知，检测结果的标准偏差为0.007 6，传感器的检出限为0.023μg/L。

表1 叶绿素传感器的检出限检测数据

同时配置4μg/L、40μg/L、150μg/L三种不同浓度叶绿素标准溶液，利用叶绿素传感器去检测三种不同浓度的溶液，连续检测7次，测量结果如表2所示。结果显示，该传感器的最大误差在2μg/L以内，在高中低三个浓度梯度的相对标准偏差分别为0.03%、0.08%、0.24%，显示出良好的测量精密度。

表2 叶绿素传感器实验误差与精密度

3.3 码头比对测试

为了验证该叶绿素传感器的可行性，将标定完成的叶绿素传感器与已检定日本亚力克AAQ171传感器，在青岛中苑码头附近海域进行对比测试，借助码头的浮标进行试验。在为期30天的现场实验期间，仪器工作状态正常，信号传输稳定。实验数据结果如图13所示。

图13 30 d内两种传感器实验数据的对比

由图13得出，研制的叶绿素传感器与日本亚力克AAQ171传感器在海试试验中的数据变化正常，且变化的动态基本相同，具有良好的波动相关度。图14为两组海试数据的比对测试，根据计算得到，其线性相关系数R＝0.824 8，表明两组数据具有较大相关程度。

图14 两组数据对比测试

据此可以得到，在实际海水环境条件下，基于荧光原理研制的光学叶绿素传感器具有较高的可靠性与准确性，并且从稳定性上来说，要优于日本亚力克AAQ171叶绿素传感器。

4 结论

本文基于荧光检测原理设计光学原位叶绿素传感器，采用锁相放大原理，通过对LED驱动、I/V转换放大、信号采集及处理等电路设计实现了对微弱荧光信号的提取与检测。实验结果表明，设计的光学原位叶绿素传感器可以准确的检测出水体中叶绿素的浓度，精度高，准确度好，具有良好的抗干扰能力，适合浮标、台站等实时原位检测，也可以将该叶绿素传感器应用于湖泊河流之中。对预防“绿潮”“赤潮”等自然灾害发生具有重要的意义。