多囊卵巢综合征患者血清microRNA-27a、microRNA-320的表达及其临床意义*

刘萍，李玮，谢宝国，于春玲

（1.海南西部中心医院 妇产科，海南 儋州571799；2.海南医学院第一附属医院生殖医学科，海南 海口570102）

多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome,PCOS）是以生殖功能障碍、内分泌和糖脂代谢紊乱、胰岛素抵抗、高雄激素血症为特征的临床综合征[1]。PCOS 病情可进展为心脑血管疾病、2型糖尿病、子宫内膜癌等远期并发症[2]。目前研究认为PCOS 是遗传和环境等多种因素共同作用的结果，但是具体病因仍不明确。microRNA 具有基因转录后表达调控作用，参与生长发育、内分泌紊乱、代谢异常等多种病理生理过程，有研究发现多种microRNA 在PCOS 中异常表达，与PCOS 发病机制密切相关[3]。研究显示microRNA-27a（miR-27a）可通过抑制过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）表达参与胰岛素抵抗过程[4-5]；microRNA-320（miR-320）则通过调控磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路，与胰岛素抵抗有关[6-7]。推测miR-27a、miR-320 与PCOS 易感和临床特征有关，但是目前报道比较少见，尚未明确结论。本文研究血清miR-27a、miR-320 在PCOS 患者中的表达及临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2017年1月—2020年8月海南西部中心医院收治的180 例PCOS 患者，符合2003年荷兰鹿特丹PCOS 会议制定标准[8]。排除标准：①合并其他内分泌紊乱性疾病；②近期服用过激素类药物患者；③卵巢癌、卵巢良性肿瘤、卵巢炎症等疾病；④高雄激素相关肿瘤或者肾上腺皮质增生。根据胰岛素抵抗指数（HOMA-IR） 分为IR 组113 例（HOMA-IR≥ 2.58）和NIR 组67 例（HOMA-IR<2.58）[9]。另选取同期于本院妇科门诊体检的80 例健康女性作为对照组。对照组纳入标准：①排卵及内分泌功能正常；②近3 个月内未服用雌激素类药物；③经B 超检查子宫卵巢形态正常排除PCOS，并经系统检查排除糖尿病、高血压、心血管疾病及肝肾功能异常者。IR 组年龄19～39 岁，平均（28.68±4.32）岁，病程2～11年，平均（6.45±1.32）年。NIR 组年龄21～39 岁，平均（28.71±4.36）岁，病程3～10年，平均（6.12±1.03）年。对照组年龄23～41 岁，平均（28.72±4.68）岁。IR 组、NIR 组、对照组年龄比较，差异无统计学意义（P>0.05）。本研究经医院医学伦理委员会批准，所有受试者签署同意书。

1.2 血清miR-27a、miR-320及临床生化指标检测

所有受试者均于月经第3～5 天采集静脉血3 ml注入干燥试管，血液凝固后取上层液4℃3 000 r/min离心15 min。采用Trizol 法提取总RNA，选择吸光度值A260/A280 比值位于1.9～2.1 的RNA 样品，采用M-MLV 逆转录酶（Epicentre 公司）将其逆转录为cDNA。CFX96 实时荧光PCR 仪（美国Bio-Rad）检测血清miR-27a、miR-320 的表达。引物序列检测及合成由上海基康公司完成。引物序列：miR-27a正向 5'-TTCACAGTGGCTAAGTTCCGC-3'，反向5'-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3'；miR-320 正向，5'-AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGA-3'，反向 5'-GCCCUCUCAACCCAGCUUUUUU-3'；β-actin 正向5'-TGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3'，反向 5'-GCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA-3'。反应体系：SYBR®Premix Ex TaqTMII（2×）12.5 μl，dNTP 1.6 μl，Taq DNA 聚合酶1 μ l，正反向引物10 μ mol/L 各1 μ l，加反应缓冲液至20 μl。反应条件：92℃预变性20 s，96℃变性2 s，85℃延伸20 s，80℃退火6 s，共30个循环。以β-actin为内参，2-ΔΔCt计算miR-27a、miR-320 mRNA 相对表达量，取3 次试验平均值。

采用美国雅培i2000 化学发光分析仪及其配套试剂测定血清促黄体生成素（LH）、促卵泡激素（FSH）、睾酮（T）。使用日立HITACHI 7600-020 全自动生化分析仪及其配套试剂，采用酶法检测血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、直接法检测低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）。美国强生稳豪血糖仪检测末梢血空腹血糖（FPG），餐后2 h 血糖（2 hBG）。美国贝克曼库尔特ACCESS 2 全自动免疫分析仪及其配套试剂检测空腹胰岛素（FINS）。根据FPG、FINS 计算稳态模型胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）。HOMA-IR=FPG×FINS/22.5。

1.3 超声检查

GE Voluson E 8 彩色多普勒超声诊断仪，探头频率7.5 MHz，于月经第3～5 天行经阴道超声检查，闭经者口服安宫黄体酮治疗撤药性出血后检查。获取卵巢最大切面后测量卵巢体积，计数卵泡数，所有数据均测量3 次取其平均值。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0 统计软件。计量资料以均数±标准差表示（±s）或中位数和四分位数[M（P25，P75）]表示，比较用单因素方差分析（进一步两两比较采用LSD-t检验）或H检验（进一步两两比较采用χ2检验）。相关性分析用Pearson 法或Spearman法。影响因素的分析用多因素Logistic 回归模型，绘制ROC 曲线。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床和实验室指标比较

IR 组、NIR 组及对照组的BMI、卵泡数、卵巢体积、T、LH、TC、LDL-C、FPG、2 hBG、FINS、HOMA-IR 比较，差异有统计学意义（P<0.05）。IR组、NIR 组卵泡数多于对照组（P<0.05），卵巢体积大于对照组（P<0.05），BMI、T、LH、TC、LDLC、FPG、2 hBG、FINS、HOMA-IR 水平高于对照组（P<0.05）；IR 组BMI、T、TC、HOMA-IR 水平高于NIR 组（P<0.05）。见表1。

表1 IR组、NIR组和对照组临床和实验室指标的比较

2.2 血清miR-27a、miR-320 mRNA 相对表达量比较

IR 组、NIR 组及对照组的血清miR-27a、miR-320 mRNA 的相对表达量比较，差异有统计学意义（P<0.05）。IR 组血清miR-27a mRNA 相对表达量高于NIR 组和对照组，miR-320 mRNA 相对表达量低于NIR 组和对照组；NIR 组血清miR-27a mRNA 相对表达量高于对照组，miR-320 mRNA 相对表达量低于对照组。见表2。

表2 3组血清miR-27a、miR-320 mRNA相对表达量比较（±s）

表2 3组血清miR-27a、miR-320 mRNA相对表达量比较（±s）

注：①与对照组比较，P<0.05；②与NIR组比较，P<0.05。

组别IR组NIR组对照组F 值P 值miR-320 mRNA 1.13±0.27①②2.01±0.45①3.02±0.69 364.541 0.000 n 113 67 80 miR-27a mRNA 4.62±1.03①②2.61±0.49①1.02±0.35 552.273 0.000

2.3 血清miR-27a、miR-320 表达与PCOS 患者临床病理特征的相关性

血清miR-27a 表达与BMI、卵泡数、卵巢体积、T、TC、HOMA-IR 呈正相关（r=0.749、0.835、0.764、0.867、0.907 和0.882，均P<0.05），miR-320 与卵泡数、卵巢体积、T、HOMA-IR 呈负相关（r=-0.791、-0.808、-0.768 和-0.752，均P<0.05）。与其他指标无相关性（P>0.05）。见表3。

表3 血清miR-27a、miR-320表达与PCOS患者临床病理特征的相关性

2.4 PCOS易感的危险因素分析

将卵泡数、卵巢体积、BMI、T、LH、TC、LDL-C、FPG、2 hBG、FINS、HOMA-IR、miR-27a、miR-320（连续性变量原值代入）纳入Logistic 回归方程，向后逐步法筛查变量。结果显示：卵泡数增加[=1.865（95% CI：1.252，2.776）]、T 水平升高[=1.536（95%CI：1.179，2.001）]、HOMA-IR 增加[=1.702（95%CI：1.185，2.446）]、miR-27a 高表达[=1.933（95%CI：1.278，2.923）]、miR-320 低表达[=0.610（95% CI：0.467，0.796）]是PCOS 易感因素（P<0.05）。校正卵泡数、T、HOMA-IR 后miR-27a[=1.625（95% CI：1.420，1.925）]、miR-320[=0.425（95% CI：0.257，0.691]仍与PCOS易感有关（P<0.05）。见表4。

表4 PCOS影响因素的多因素Logistic回归分析相关参数

2.5 miR-27a、miR-320对PCOS的诊断价值

miR-27a、miR-320 诊断PCOS 的最佳截断值为2.02、2.29。AUC 分别为0.708（95% CI：0.637，0.779）、0.676（95% CI：0.602，0.750），敏感性分别为72.8%（95% CI：0.670，0.779）、71.1%（95% CI：0.650，0.767），特异性分别为70.0%（95% CI：0.610，0.777）、68.8%（95% CI：0.597，0.766）。联合两项指标诊断PCOS 的AUC 为0.917（95% CI：0.869，0.964），高于单独指标诊断（Z=2.356 和2.612，P=0.013 和0.003），联合诊断敏感性为93.9%（95% CI：0.902，0.963），特异性为91.3%（95% CI：0.845，0.954）。见图1。

图1 miR-27a、miR-320单独和联合诊断PCOS的ROC曲线

3 讨论

PCOS 是生殖系统内分泌、代谢异常综合征，以月经紊乱、不孕、高雄激素血症、影像学提示卵巢增大和（或）多囊卵巢为主要症状。遗传、糖尿病家族史、低出生体重是PCOS发病危险因素。PCOS多伴有高胰岛素血症、血脂异常、超重或肥胖，是糖尿病和心血管疾病发展的危险因素[10]。胰岛素抵抗是PCOS发病的始动因素，也是高胰岛素血症和高雄激素血症的病理生理改变基础，胰岛素抵抗介导的并糖脂代谢紊乱[11]。miRNA 是一组长度为22～25 个核苷酸的非编码RNA 分子，通过转录后调控胰岛素抵抗以及葡萄糖代谢相关蛋白表达，参与肥胖、糖尿病及PCOS等发病过程[12]。

miR-27a 是miRNA 家族中功能最显著的成员之一，位于19p13.13号染色体，具有调控细胞增殖分化、血管生成、促炎等多种生物学功能，现有研究显示miR-27a 降低Toll 样受体4 的表达，抑制缺血再灌注损伤中的炎症反应，抑制肾小管上皮细胞[13]，miR-27a表达与大肠癌患者远处转移和肿瘤分级有关[14]。本研究发现miR-27a 在PCOS 中高表达，miR-27a 表达与卵巢体积、卵泡数、T 呈正相关，miR-27a 高表达是PCOS发病的危险因素，说明miR-27a与PCOS易感以及卵巢体积增加、卵泡数增多以及高雄激素血症有关。现有研究显示miR-27a在卵巢颗粒细胞中有丰富表达，参与卵巢滤泡发育的过程，miR-27a通过靶向Smad5激活FasL-Fas途径诱导人颗粒细胞的凋亡，导致卵巢功能早衰[15]。进一步分析发现miR-27a 与PCOS 患者的BMI、TC、HOMA-IR 呈正相关，说明miR-27a 可能与PCOS 肥胖、糖脂代谢紊乱以及胰岛素抵抗有关。miR-27 在脂肪组织中表达，是PPARγ的直接靶标和负调节因子，PPARγ 具有调节全身脂质代谢和胰岛素敏感性作用，循环血中miR-27a通过调控PPAR-γ 的表达调节脂肪细胞分化[16]。miR-27a过表达可下调PPAR-γ 表达抑制脂肪细胞分化，导致脂肪组织堆积和肥胖，并影响脂质代谢[6]，同时miR-27a 还可通过靶向葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）/丝裂原激活的蛋白激酶14（MAPK 14）/PI3K 调节亚基β 信号通路参与葡萄糖代谢调节，miR-27a 表达可抑制葡萄糖消耗和摄取，诱导葡萄糖代谢异常和胰岛素抵抗[17]。miR-27a 可作为PCOS 诊断的潜在生物标志物[18]。

miR-320具有调控细胞增殖分化、抗炎、抗氧化等作用，现有研究显示miR-320a 在上皮性卵巢癌组织低表达，miR-320 低表达可促使上皮-间质转化，导致肿瘤细胞增殖及细胞侵袭力增强，促使癌症恶性进展[19]。miR-320还可通过激活脂肪酸代谢基因的转录，介导心脏脂质毒性，诱导糖尿病患者心脏功能障碍[20]。但是其在PCOS 的作用较少报道。本研究发现miR-320 在PCOS 中低表达，miR-320 低表达与PCOS易感、卵巢超声形态异常、高雄激素血症均有关。CIRILLO 等[21]报道同样显示PCOS 患者颗粒细胞中miR-320 表达下调，miR-320 表达与胰岛素水平呈负相关。YIN等[22]研究结果显示miR-320 通过直接靶向E2F转录因子-1（E2F-1）和类固醇形成因子-1（SF-1）调节卵巢颗粒细胞增殖和雌激素生成。E2F-1是一种激活S期所需基因的转录因子，E2F-1活性增强可促使细胞周期向S期转换，诱导细胞凋亡[23]，SF-1在类固醇生成组织的发育和分化中起着重要作用，SF-1受抑制可增强雌激素信号传导[24]。miR-320可能通过抑制E2F-1，SF-1 表达抑制颗粒细胞凋亡，诱导雌激素合成，miR-320表达缺失则导致卵巢颗粒细胞凋亡，雌激素合成障碍，雄激素水平升高。进一步分析发现miR-320 与PCOS 患者胰岛素抵抗水平有关，分析原因为：磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）p85 亚基是miR-320潜在靶标，miR-320通过PI3K信号传导途径增强p85表达增加和Akt磷酸化，上调GLUT-4表达，促使葡萄糖摄取，抑制胰岛素抵抗[25]。

miR-27a、miR-320 诊断PCOS 均有一定价值，为进一步提高诊断效能，本研究将两项指标联合用于诊断PCOS，结果显示诊断效能明显提高，分析原因为联合检测可避免单独检测漏误诊弊端，诊断效能显著提高。

综上所述，PCOS 患者血清miR-27a 表达上调，miR-320 表达下调，miR-27a 高表达、miR-320 低表达与PCOS 易感和胰岛素抵抗均有关，miR-27a 可能还参与PCOS 患者肥胖以及脂质代谢紊乱机制。miR-27a、miR-320可作为PCOS诊断的参考指标，两者联合可提高诊断效能。本研究局限之处在于仅检测月经第3～5天的miR-27a、miR-320水平，miR-27a、miR-320是否受月经周期影响尚不清楚，希望在以后的研究中进一步拓展。