我国鸡传染性支气管炎病毒的遗传变异和进化分析

李玉杰 盛媛 魏秀丽 徐恩民 吴静 刘娜 马秀丽

摘 要：本研究测定了2020年以来本实验室从不同地区分离的44个IBV毒株的S1基因序列，并与参考株序列进行比较分析。结果发现分离的44个IBV毒株共占据5个分支。其中：第一分支为QX型，包括25个分离株，QX型分离株又分为ClusterⅠ亚分支（7个）和ClusterⅡ亚分支（18个）;第二分支为4/91型，包括12个分离株;第三分支为LDT3型，包括3个分离株;第四分支为Mass型，包括2个分离株;第五分支为TW型，包括2个分离株。从毒株遗传进化分析结果可以看出，QX型仍是我国IBV流行的主要基因型。

关键词：传染性支气管炎病毒;S1基因;遗传变异;进化变异

中图分类号：S858.31 文献标识码：B文章编号：1673-1085（2021）6-0005-05

传染性支气管炎（IB）是鸡的一种急性、高度接触性的病毒性呼吸道疾病，在国内流行甚广。传染性支气管炎病毒（IBV）属于冠状病毒科冠状病毒属的成员之一，其基因组为单股线状正链RNA，含有3种主要结构蛋白，即纤突蛋白S、膜蛋白M和核蛋白N。S1基因是IBV基因组中最易发生变异的部位，其编码蛋白可诱导机体产生IBV特异的中和抗体和血凝抑制抗体，S1蛋白在进化上比M蛋白和N蛋白都表现活跃，因此可不断导致IBV新的血清型、亚型和变异株的产生，致使IBV疫苗免疫失败，给鸡传染性支气管炎的防制带来新的困难。

由于传染性支气管炎病毒血清型和变异株众多，各型之间无交叉反应或交叉反应差。因此，对于传染性支气管炎的防控，首先需明确当地流行传染性支气管炎的血清型和变异株。从分子水平揭示近年来IBV的变异情况以及不同毒株之间的进化关系，对我国今后开展传染性支气管炎的监测和综合防控具有重要的指导意义。因此，本研究针对2020年以来从不同地区分离的44株IBV毒株进行S1基因序列测定，比较分析了分离毒株的遗传演化，明确流行的基因型与变异趋势，对疫苗选择和疾病防控具有参考价值。

1 材料与方法

1.1 IBV毒株

2020年至今实验室分离保存的IBV毒株，详细背景见表1。

1.2 RT-PCR扩增、克隆与测序

按常规RT-PCR方法扩增不同IBV毒株的S1基因。将PCR产物克隆至pMD18-T载体中，鉴定为阳性的重组子送北京博尚有限公司完成测序。

1.3 S1基因序列分析

分别对测定的毒株进行S1基因核苷酸序列分析，用Boot-strap法（Replication值为1000）计算遗传距离并绘制N-J进化树，其中Bootstrap值小于50%的数值未显示，分析当前国内IBV的流行情况及不同毒株核苷酸的变异程度。

2 结果

2.1 IBV S1基因的扩增与克隆

利用自行设计的引物对分离毒株的RNA模板进行RT-PCR扩增，结果分离毒株均能扩增出1600 bp左右的目的片段，见图1（只列出其中7个代表株）;将PCR产物纯化后克隆至pMD18-T载体中，菌液PCR鉴定阳性的重组子送测序。

2.2 IBV S1基因的核苷酸序列相似性与遗传进化分析

通过对44个IBV分离株与代表毒株的S1基因测序分析发现，分离株共占据5个分支（图2）。其中，第一分支为Mass型，包括2个分离株，与疫苗株的序列相似性为98.9%;第二分支为LDT3型，包括3个分离株，与LDT3毒株的序列相似性均为84.5%～95.5%;第三分支为TW型，包括2个分离株，与台湾型代表毒株的序列相似性为82%～84.7%;第四分支为4/91型，包括12个分离株，与4/91毒株的序列相似性为89.1%～99.3%;第五分支为QX型，包括25个分离株，与QX毒株的序列相似性为90.9%～96.6%，QX型分离株又分为ClusterⅠ亚分支（7个）和ClusterⅡ亚分支（18个）。

3 讨论与分析

本研究通过对2020年以来分离的44株传染性支气管炎病毒的测序分析，发现不同分离株之间序列相似性及遗传进化差异较大，提示我国IBV分离株S1基因在不断进化过程中已出现亚分支甚至更细分支，该特点对当地IB的防控造成更大挑战。

遗传进化关系分析发现，QX型仍是我国IBV的主流基因型，约占56.8%。25株QX型毒株进化为两个亚分支，其中ClusterⅠ分離株与QX代表株在同一亚分支，ClusterⅡ分离株与经典参考株LX4在同一亚支上，这可能与ClusterⅠ分支IBV S1基因的核苷酸发生了多个点突变有关;其次是4/91型的IBV毒株，约占27.3%，LDT3分支毒株仅占6.8%。尽管有报道国内台湾型大陆分离株的分离率逐年升高[5-6]，但2020年以来本实验室仅分到2株TW型毒株，而且这两个毒株均来源于江苏地区，山东地区未分离到该型毒株，但应引起大家对TW型毒株的重视。这两个毒株的致病性有待进一步深入研究。

由于不同的血清型之间交叉仅有部分或完全没有交叉免疫保护，因此在免疫过传染性支气管炎疫苗的鸡群中，仍然会出现免疫失败现象，这可能与现有疫苗（H120、H52、Ma5、4/91、LDT3、

QX）的种类较多、疫苗搭配不合理导致疫苗基因型与分离株基因型不能完全匹配造成的。此外，弱毒疫苗的优点是能有效刺激肉鸡的体液与细胞免疫，但病毒可在免疫鸡群中持续存在，从而成为IBV重组变异的供体。因此，传染性支气管炎的防控应优先选用与当地流行基因型相一致的疫苗，这样可以尽量减少本地区IBV重组变异的概率。

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