坎地沙坦对肝纤维化大鼠的干预作用及其分子机制▲

王晓露 张 坤 曾庆鑫 胡 海 孙 洁 王彭峰

(内蒙古科技大学包头医学院1 基础医学与法医学院，2 病理生理学教研室， 包头市 014060，电子邮箱：787851491@qq.com；3 内蒙古包钢医院神经内科，包头市 014060；4 内蒙古科技大学包头医学院乌兰察布临床医学院，包头市 014060)

肝纤维化是由慢性肝损伤引起的纤维化和炎症过程，是向肝硬化、肝癌进展的早期阶段。在肝纤维化进展过程中，以肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)为中心，多种细胞因子及其相关信号通路相互影响，共同对肝纤维化的发生和发展起调节作用[1]。HSC定位于肝细胞和窦性内皮细胞之间的窦间隙，静态HSC主要用于储存维生素A，在慢性肝损伤发生时，炎症介质促进HSC活化并分化为成肌纤维细胞，随之α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)、Ⅰ型胶原等细胞外基质(extracellular matrix，ECM)成分分泌增多，导致肝纤维化的发生和发展[2]。有研究表明，血管紧张素受体拮抗剂(angiotensin receptor blocker，ARB)氯沙坦与人血清白蛋白联合使用可减轻晚期肝纤维化程度，但是ARB类药物对肝纤维化的干预机制尚不清楚[3]。本研究应用ARB类药物坎地沙坦对四氯化碳致肝纤维化大鼠进行实验性治疗，观察该药物对大鼠肝纤维化的保护作用，探讨其对HSC激活的影响及其分子机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 无特定病原体级SD雄性大鼠40只，5～6周龄，体重180～220 g，由北京市斯贝福生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(京)2016-0002。

1.2 主要试剂 四氯化碳购自上海榕柏生物科技有限公司(批号：HX7484)，橄榄油购自北京中企华业食品有限公司；坎地沙坦酯片购自广州白云山天心制药股份有限公司；AST和ALT测定试剂盒购自南京建成生物技术研究所(批号：c010-2、c009-2)；α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白兔多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司(批号：A03744、BA0325)，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)兔多克隆抗体购自上海生工生物工程股份有限公司(批号：B661204-0001)，二抗购自北京瀚海拓新生物技术有限公司(批号：KIT-9710)；TRIzol试剂购自天根生化科技有限公司(批号：DP405-02)，RT-PCR两步法试剂盒购自北京天根生物技术有限公司(批号：KR103-03)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组、肝纤维化模型建立及给药方法：采用随机数字表法将40只SD大鼠分为对照组、模型组以及坎地沙坦高、中、低剂量组，每组8只。所有大鼠均自由饮水，同时给予标准饲料喂养。对照组给予皮下注射橄榄油5 mL/kg，其余各组大鼠给予皮下注射橄榄油稀释的10%四氯化碳5 mL/kg(橄榄油与四氯化碳体积比为9 ∶1)，每周2次，共20周。从造模第5周开始，坎地沙坦高、中、低剂量组分别每日给予坎地沙坦20 mg/kg、10 mg/kg和5 mg/kg灌胃治疗，同时对照组与模型组给予0.9%生理盐水5 mg/kg灌胃直至造模结束。

1.3.2 标本获取及保存： (1)血清标本采集。造模结束后大鼠禁食不禁水8 h，称重，麻醉后开腹，于腹主动脉取血8～10 mL，静置2 h后离心(4 000 r/min，4℃)15 min后取上清液，分装后于-80℃冰箱冻存。(2)肝组织标本收集。完整切离肝脏，分别于各肝叶处取一块肝脏(厚约4 mm)，于4%多聚甲醛固定液中固定至少24 h，常规脱水、石蜡包埋；将剩余肝脏组织切块，分装于冻存管中，于-80℃冰箱冻存。

1.3.3 肝功能指标测定：取上清液，严格按照试剂盒说明书操作，测定血清AST和ALT水平。

1.3.4 肝纤维化评分：取蜡块连续切片，切片厚度为 3～5 μm，苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色法染色后镜下观察。每张切片取5个视野拍照，应用 Ishak 评分标准[4]进行肝纤维化评分。

1.3.5 PCR检测：使用TRIzol法提取组织总RNA，经琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop分光光度计测定RNA的质量和浓度，A260/A280为1.18～2.10。使用反转录PCR两步法试剂盒将RNA反转录成cDNA后进行扩增反应，PCR体系包括cDNA模板2 μL、上下游引物各1 μL、2×Tag PCR Master Mix 12.5 μL、ddH2O 8.5 μL。PCR扩增步骤：α-SMA为94℃预变性2 min，35个循环(94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s)，72℃最后延伸5 min；Ⅰ型胶原蛋白为94℃预变性 2 min，35个循环(94℃变性30 s，56℃退火30s，72℃延伸30 s)，72℃最后延伸5 min；GAPDH为94℃预变性2 min，35个循环(94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s)，72℃最后延伸5 min。将PCR反应产物分别在2%琼脂糖凝胶上电泳，用Tanon 1600凝胶成像系统对DNA条带进行吸光度扫描，与相应GAPDH吸光度的比值为α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白 mRNA的相对表达水平。α-SMA上游引物序列为5′-TGTGCTGGACTCTGGAGATG-3′，下游引物序列为3′- GATCACCTGCCCATCAGG-5′(291 bp)；Ⅰ型胶原蛋白上游引物序列为5′- GGCAAGACAGTCATCGAATACA-3′，下游引物序列为3′-GATTGGGATGGAGGGAGTTTA-5′(147 bp)；GAPDH上游引物序列为5′-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3′，下游引物序列为3′-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-5′(92 bp)。

1.3.6 免疫组化分析：取肝组织石蜡切片，采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结(streptavidin-perosidase,SP)法检测Ⅰ型胶原蛋白和α-SMA蛋白的表达，将石蜡包埋的肝组织切成5 μm切片，依次放入二甲苯、乙醇中，抗原修复后，依次滴加一抗、二抗，用二氨基联苯胺显色后，镜下观察，视野中呈棕黄色的细胞为阳性细胞，主要着色部位在细胞间隙。每张切片随机选取5个视野拍照，应用图像分析软件Image-Pro-Plus 6.0测定目的蛋白的平均光密度值(积分光密度/组织面积)，用于反映目的蛋白的相对表达水平。

1.4 统计学分析 应用SPSS 24.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析法，两两比较采用LSD-t检验或Dunnett-T3检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠肝组织形态学观察及纤维化评分 肉眼观察：对照组大鼠肝脏表面光滑，边缘整齐；模型组大鼠肝脏略增大，边缘钝，表面可见粗颗粒状凸起，手感粗糙，与周围器官有轻度粘连；坎地沙坦各剂量组大鼠肝脏略增大，表面可见散在出血点，个别大鼠肝脏与周围器官有轻度粘连。镜下观察：对照组大鼠肝小叶结构完整清晰，肝细胞呈条索状排列整齐，呈放射状分布；模型组大鼠肝小叶结构被破坏，纤维间隔形成且伴有大量气球样变，汇管区可见炎性细胞浸润；与模型组相比，坎地沙坦各剂量组大鼠肝脏纤维间隔变窄，气球样变程度减轻，炎性细胞数量减少。见图1。

对照组 模型组 坎地沙坦高剂量组 坎地沙坦中剂量组 坎地沙坦低剂量组

5组大鼠肝组织的Ishak评分差异有统计学意义(P<0.05)。其中，其他4组的评分高于对照组(P<0.05)；坎地沙坦高剂量组的评分低于模型组、中剂量组和低剂量组(均P<0.05)；而坎地沙坦中、低剂量组的评分与模型组比较，中剂量组与低剂量组比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 5组大鼠肝组织Ishak评分的比较(x±s，分)

2.2 各组大鼠血清ALT和AST水平的比较 5组大鼠的血清ALT和AST水平差异有统计学意义(均P<0.05)。其中，模型组血清ALT和AST水平均高于对照组(均P<0.05)；坎地沙坦高、中、低剂量组血清ALT表达水平均低于模型组，且坎地沙坦高、中剂量组血清ALT水平低于低剂量组(均P<0.05)，而坎地沙坦高、中剂量组血清ALT水平与对照组比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)；坎地沙坦高、中、低剂量组血清AST水平均高于对照组(均P<0.05)，而模型组与坎地沙坦高、中、低剂量组血清AST水平两两比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表2。

表2 5组大鼠血清ALT和AST水平的比较(x±s，U/L)

2.3 各组大鼠肝组织Ⅰ型胶原蛋白mRNA和α-SMA mRNA的表达情况 5组大鼠肝组织的Ⅰ型胶原蛋白 mRNA和α-SMA mRNA相对表达水平差异均有统计学意义(均P<0.05)。其中，与对照组比较，模型组大鼠肝组织Ⅰ型胶原蛋白 mRNA和α-SMA mRNA相对表达水平均升高(均P<0.05)；与模型组比较，坎地沙坦高、中、低剂量组Ⅰ型胶原蛋白mRNA和α-SMA mRNA相对表达水平均降低(均P<0.05)；坎地沙坦各剂量组之间α-SMA mRNA相对表达水平比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，而坎地沙坦高剂量组Ⅰ型胶原蛋白mRNA相对表达水平均低于坎地沙坦中、低剂量组(均P<0.05)。见图2和表3。

图2 大鼠肝组织Ⅰ型胶原蛋白和α-SMA mRNA水平比较

表3 5组大鼠肝组织Ⅰ型胶原蛋白和α-SMA mRNA相对水平的比较(x±s)

2.4 各组大鼠肝组织Ⅰ型胶原蛋白和α-SMA蛋白的表达情况 (1)在对照组大鼠肝组织中，仅在中央静脉及汇管区周围可见极少量Ⅰ型胶原蛋白沉积；模型组可见Ⅰ型胶原蛋白大量表达，尤其在肝组织中央静脉及汇管区周围、纤维间隔周围；在坎地沙坦各剂量组中，Ⅰ型胶原蛋白的表达集中在中央静脉及汇管区周围。 见图3。模型组Ⅰ型胶原蛋白表达量水平高于对照组(P<0.05)，坎地沙坦各剂量组Ⅰ型胶原蛋白表达水平均低于模型组(均P<0.05)，坎地沙坦高剂量组Ⅰ型胶原蛋白表达水平低于坎地沙坦低剂量组、坎地沙坦中剂量组(均P<0.05)，但坎地沙坦低、中剂量组之间Ⅰ型胶原蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。(2)在对照组大鼠肝组织中，仅在中央静脉壁和汇管区动、静脉壁有少量α-SMA蛋白表达；与对照组相比，模型组α-SMA大量表达，尤其在纤维增生的汇管区，中央静脉及汇管区周围、纤维间隔周围；在坎地沙坦各剂量组中，α-SMA的表达集中在中央静脉及汇管区周围，纤维间隔伴有少量增生。见图4。模型组α-SMA蛋白表达水平高于对照组(P<0.05)，模型组、坎地沙坦低剂量、坎地沙坦中剂量、坎地沙坦高剂量的α-SMA表达水平依次降低(均P<0.05)，见表4。

对照组 模型组 坎地沙坦高剂量组 坎地沙坦中剂量组 坎地沙坦低剂量组

对照组 模型组 坎地沙坦高剂量组 坎地沙坦中剂量组 坎地沙坦低剂量组

表4 5组大鼠肝组织Ⅰ型胶原蛋白和α-SMA蛋白表达水平的比较(x±s)

3 讨 论

肝纤维化是由于慢性肝损伤导致的ECM过度沉积的病理过程，其病因主要有酒精性肝炎、非酒精性脂肪肝、慢性病毒性肝炎和自身免疫性肝病等，其共同细胞机制是肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)的激活。在慢性肝病中，静止期HSC分化为活化的HSC，活化型HSC失去细胞内脂质滴并获得肌成纤维细胞表型，其特征在于α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白等ECM的表达增加，进而导致肝实质和血管结构被破坏，引起肝功能受损和肝纤维化[5-6]。因此，肝组织α-SMA和Ⅰ型胶原表达增多，在一定程度上反映了HSC的激活情况，也是促进肝纤维化发生和发展的重要分子机制。

本实验采用四氯化碳法复制肝纤维化大鼠动物模型，经肝组织病理学检查发现模型组大鼠肝小叶结构被破坏，纤维间隔明显增生，肝纤维化Ishak评分较对照组升高，说明本实验成功复制了肝纤维化大鼠的动物模型。检测肝功能指标发现，模型组血清AST和ALT水平高于对照组，说明肝纤维化发生后，肝组织病理变化即结构损害导致细胞膜通透性增加，ALT和AST从细胞溢出入血[7-8]。当ECM过多沉积时会压迫静脉和门静脉。当门静脉阻力增加至超出人体代偿能力时，门静脉血流速度和血流会减少，血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)在该过程中发挥重要作用，ARB则通过阻断AngⅡ与其受体AT1结合而发挥抗纤维化作用。本实验中，应用ARB类药物坎地沙坦对肝纤维化大鼠进行治疗后，光镜下可见肝组织纤维间隔变窄，气球样变程度减轻，炎性细胞数量减少，且坎地沙坦高剂量组的Ishak评分均较模型组和坎地沙坦中剂量组、低剂量组有所降低，提示20 mg/kg剂量的坎地沙坦可以改善肝纤维化。同时，坎地沙坦可降低肝纤维化大鼠的血清ALT水平，对大鼠的肝功能具有一定的保护作用，且高、中剂量的坎地沙坦的效果更好。

α-SMA是一种收缩性蛋白，通常在血管平滑肌细胞中表达，有助于血管运动和收缩。在肝损伤过程中，HSC转化为活化的成肌纤维细胞，从而使α-SMA合成增多并促进肝纤维化进展[9]。同时，肝纤维化病理过程是一种伤口愈合反应，其特征为正常的、富含Ⅳ型胶原的ECM被主要由Ⅰ型胶原组成的间质“瘢痕”基质逐渐取代。Yang等[10]研究发现，HSC通过分泌Ⅰ型胶原蛋白触发肝癌细胞的上皮间质转化。上述研究提示α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白的表达量可衡量HSC活化的程度和判断肝纤维化的程度。因此，本实验通过检测大鼠肝组织α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白的mRNA和蛋白的表达量，观察肝纤维化大鼠模型中HSC的激活程度，以及应用坎地沙坦实验性治疗对HSC活化程度的影响。结果显示，模型组大鼠肝组织中α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白的mRNA和蛋白表达较对照组升高，而应用坎地沙坦干预后，各治疗组的α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白mRNA和蛋白表达均较模型组降低，且坎地沙坦高剂量组α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白的蛋白表达水平低于其他两个剂量组(均P<0.05)。这表明，肝纤维化大鼠存在HSC的激活，而坎地沙坦对HSC的活化有抑制作用，且坎地沙坦高剂量组的作用更强。

综上所述，ARB类药物坎地沙坦能够通过抑制HSC的激活来改善肝纤维化大鼠的肝功能，并降低肝纤维化程度，以高剂量(20 mg/kg)的干预效果最明显，其分子机制可能与该药物下调肝组织α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白的表达有关。