QuEChERS-UPLC法快速测定罗汉果和土壤中阿维菌素的残留量

陈晓兰，蔡翔宇，邓全道

1. 桂林海关（桂林 541004）；2. 南宁海关技术中心（南宁 530021）

罗汉果，系葫芦科多年生滕本植物的果实，主要分布在我国广西桂林地区，属于当地特有的经济农作物，也是当地传统出口商品之一。阿维菌素属于十六元大环内酯类化合物，由灰色链霉菌发酵产生，天然阿维菌素包括8个组分，其中B1为主要活性成分。由于具有触杀、胃毒作用及渗透力强等特点，阿维菌素被广泛应用于防治果树、蔬菜、花卉等多种作物上的害虫[2]。在罗汉果种植过程中，该农药也是用来防治各种病虫害的首选。然而，按世界卫生组织（WHO）五级分类标准，阿维菌素属高毒化合物[3]，在农产品上残留量过高将直接影响人们的身体健康，甚至可能会引起食物中毒。为此，国内外均对农产品的阿维菌素残留量有着严格的限量规定[4-7]。

关于阿维菌素残留的检测在农产品及土壤上已有较多详细的报道[8-14]。然而，应用超高效液相色谱（UPLC）测定阿维菌素的文献却较少报道，尤其在罗汉果上更是未曾见有。此外，由于QuEChERS前处理技术[15]具有简单、快速、有效、可靠及安全等特点，目前已被各实验室广泛应用于农食产品中的农药残留分析[16-19]。因此，试验在前人研究的基础上，优化QuEChERS基质固相分散萃取的条件，考察样品的基质效应，建立超高效液相色谱法测定罗汉果和土壤中阿维菌素的残留量；在此基础上应用建立起来的分析方法，分别检测阿维菌素在施药后不同时间罗汉果和土壤中的残留量，总结其消解动态规律。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙腈、甲醇（色谱纯，美国Fisher公司）；无水硫酸镁（分析纯，上海安谱实验公司）：使用前在650 ℃下灼烧4 h；氯化钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）：使用前用140 ℃烘烤4 h；石墨化炭黑（GCB）、N-丙基乙二胺硅烷（PSA）、十八烷基键合硅胶（C18）：德国CNW公司；阿维菌素标准品（含量＞99%，德国Dr公司）：用甲醇溶解并定容，配制成1000 mg/L的标准储备液，于4 ℃避光保存。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱仪（Acquity UPLC型且配有电子紫外分光检测器，美国Waters公司）；超纯水设备（Milli-Q，美国Milipore公司）；涡旋器（OT-2A，上海琪特公司）；电子天平（瑞士Metler Toledo公司）；高速离心机（3K15，德国SIGMA公司）；均质器（GT200，北京格瑞德曼公司）。

1.3 样品检测

1.3.1 样品前处理

1.3.1.1 罗汉果样品

提取：准确称取10.0 g试样，加入20 mL乙腈，高速均质器提取2 min，再加入2 g氯化钠盐析，涡旋混匀，以8000 r/min离心5 min，吸取全部上清液。加入3 g无水硫酸镁于上清液中，涡旋混合，取出全部上清液，在35 ℃水浴下旋转蒸发至近干，用2 mL乙腈复溶，待净化。

净化：取1 mL复溶液于预先装有50 mg PSA和50 mg C18的15 mL离心管中，涡旋混匀，以8000 r/min离心5 min，取上清液过0.22 μm微孔滤膜，待UPLC测定。

1.3.1.2 土壤样品

精确称取5.0 g试样（在分析样品前先测定土壤的含水率）于离心管中，加入5 mL的超纯水以及10 mL乙腈，超声辅助提取15 min，再加入2 g氯化钠盐析，接下来的操作步骤同上述。

1.3.2 超高效液相色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC C18色谱柱（2.1 mm× 100 mm×1.7 μm，美国Waters公司）；柱温35 ℃；进样量10 μL；检测波长245 nm；流动相A为超纯水，流动相B为乙腈，流动相梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序

1.3.3 纯溶剂标准溶液与基质匹配标准溶液的配制

分别用乙腈和基质（罗汉果、土壤）空白对照液，稀释配制成10 mg/L标准储备液和基质匹配标准储备液，再各自逐级稀释得到0.05，0.1，0.25，0.50，1.0，2.0和5.0 mg/L的标准系列，按1.3.2小节的条件测定。

2 结果与分析

2.1 基质固相萃取填料的优化

2.1.1 填料种类的选择

QuEChERS前处理方法的显著特点就是在净化过程中使用各种固相萃取吸附填料，常用的有C18、PSA以及GCB等。C18主要用于除去试样中脂溶性色素和脂肪等大部分非极性杂质，PSA主要吸附基质中的糖类和脂肪类等极性杂质，而GCB则可以有效去除色素、甾醇类和非极性干扰物；与此同时，这些填料在去除基质中杂质的同时也有可能对目标化合物产生各种不同程度的吸附。因此，在前处理过程中，如何选择合适的填料，达到既能去除杂质从而降低基质噪声的干扰又能避免对目标化合物的过度吸附的效果，这才是关键。

分别将2 mL 200 μg/L阿维菌素纯溶剂标准溶液和基质匹配标准溶液，各自经预装有4种不同固相萃取填料进行吸附净化处理，按1.3.2小节的条件测定，回收率结果见表2。纯溶剂标准溶液经不同固相萃取填料处理后的色谱图如图1所示（阿维菌素出峰时间t=2.62 min）。

图1 纯溶剂阿维菌素标准溶液经不同固相萃取填料处理后的色谱图

从表2可见，阿维菌素经GCB处理，回收率在5.0%左右，由此可见GCB对存在平面结构的化合物阿维菌素产生了非常强烈的吸附；经C18、PSA和C18+PSA分别处理，回收率分别为99.4%，87.7%和92.6%，由此可知C18对阿维菌素的吸附几乎可以忽略不计，而PSA则有一定的吸附。与此同时，在进行基质匹配标准溶液吸附试验时，C18、PSA以及PSA+C18对阿维菌素均未产生明显的吸附作用，回收率均显著提高，这有可能是PSA中原本吸附阿维菌素的很多活性位点被基质占据，从而减少了对目标物的吸附。此外，从肉眼可见，单独使用C18或PSA时，净化液均有一定的颜色，而使用PSA+C18时净化液则澄清透明，这可能是因为两者结合带来的净化效果更佳。以净化效果以及回收率综合考虑，故最终选择PSA+C18组合作为固相萃取吸附填料来净化提取液。

表2 阿维菌素经不同固相萃取填料吸附净化处理后的回收率

2.1.2 填料用量的优化

固相萃取填料的用量也会对净化效果产生影响，用量过少，基质中的杂质去除不彻底；用量过多，则会吸附目标物化合物，造成回收率损失。因此，通过考察25 mg C18+25 mg PSA，25 mg C18+50 mg PSA，50 mg C18+25 mg PSA，50 mg C18+50 mg PSA，50 mg C18+75 mg PSA，75 C18+50 mg PSA和100 mg C18+100 mg SA这7组不同用量的萃取填料分别对罗汉果和土壤中阿维菌素回收率的影响，从而选择最优的填料用量方案，结果如图2所示。PSA+C18填料对杂质的去除作用随用量增加而增强，净化效果越来越好，基质噪音降低，回收率稳步提升。但是，随着填料进一步增加到一定程度，回收率变化不大甚至出现回落现象，很大的原因是过多的填料吸附了目标化合物。因此，综合考虑回收率、净化效果以及经济因素，最终确定50 mg C18+50 mg PSA为最佳的固相萃取填料选择方案。

图2 经不同用量的萃取填料组合处理后对罗汉果和土壤中阿维菌素回收率的影响

2.2 基质效应

在分析过程中，基质效应的存在会影响分析结果的准确度与精密度，干扰样品目标物的定量分析。因此，在建立分析方法时，应对基质效应进行评估，并采取适宜的方法消除或减少基质效应的影响，从而确保测定结果的可靠性。

分别采用1.3.3小节配制好的纯溶剂标准溶液与基质匹配标准溶液系列制成的不同标准曲线，计算各自在同一个添加浓度水平下的回收率，通过两者比值来评价基质效应。公式：|ME|=|（B-A）|（A和B分别为用纯溶剂标准曲线和基质匹配标准曲线各自计算目标物的回收率）。当|ME|≤10%时，表示基质效应较小，可用纯溶剂标准溶液曲线定量；当10%＜ |ME|≤50%时，表示基质效应较大，需用基质匹配标准曲线定量以消除基质效应的影响。

由表3可知：在0.01～0.5 mg/kg的添加水平下，用纯溶剂标准溶液曲线进行校正时，阿维菌素在罗汉果和土壤中的回收率范围分别是57.6%～64.1%和65.6%～ 72.3%，基质效应|ME|分别是27.3～36.3和23.6～28.8，意味着基质效应较大，并且经过基质匹配标准溶液校正后得到较好的回收率，故试验采用基质匹配外标法进行校正定量。

表3 阿维菌素在罗汉果和土壤中的基质效应、平均回收率及精密度（n=6）

2.3 方法学验证

2.3.1 方法的线性关系与检出限

对1.3.3小节制备好的基质匹配标准溶液系列进行分析，以峰面积为纵坐标（Y），浓度为横坐标（X），绘制回归曲线。结果显示，在0.05～5.0 mg/kg浓度范围内，罗汉果和土壤回归方程的相关系数（R2）分别为0.9946和0.9987，说明目标化合物组分在此浓度范围内线性关系良好。以满足信噪比S/N≥3的最小添加水平作为方法的检出限（Limits of detection，LOD），以满足信噪比S/N≥10并且添加回收率的相对标准偏差[（Relative standard deviation，RSD，且n=6）]≤20%的最小加标水平作为定量限（Limits of quantitation，LOQ）。计算结果得知，阿维菌素在罗汉果基质中的SLOD为2.3 μg/kg，SLOQ为7.2 μg/kg；土壤中的SLOD为3.1 μg/kg，SLOQ为9.5 μg/kg。

2.3.2 方法的回收率及精密度

取罗汉果和土壤空白样品进行3个加标水平的回收率和精密度试验，参考GB 2763—2019[10]关于食品中阿维菌素最大残留限量的限定范围，设定添加质量浓度水平0.01，0.1和0.5 mg/kg，每个添加水平重复测定6次。由表3可知，罗汉果和土壤方法的平均回收率分别为84.9%～99.5%与89.2%～101.1%，相对标准偏差均小于10%。罗汉果或土壤空白及加标样品色谱图见图3。

图3 罗汉果或土壤空白及加标样品色谱图

2.4 实际样品的测定

2.4.1 样品的采集

在桂林罗汉果主产地临桂县的夏榴村基地，分别对罗汉果植株和土壤均匀喷施阿维菌素药液（施药剂量为30 g a. i./hm2）。各自于施药后2 h及1，2，3，5，7，10，14和21 d采集罗汉果和土壤样品，另设不施药空白对照区。所有采集的样品置于-18 ℃贮存，等待检测。

2.4.2 残留结果的测定

应用所建方法测定施药后不同时间点采集样品中的阿维菌素残留量，结果如表4所示。阿维菌素在罗汉果及土壤中的残留量检出范围分别为0.029～0.305 mg/kg和0.092～0.984 mg/kg；消解过程均符合一级动力学方程，在罗汉果中的半衰期为1.9 d，在土壤中的半衰期为4.4 d。另外，从表4还可以看出，施药后第7天阿维菌素在罗汉果上的降解率达到90%以上，施药后10 d阿维菌素浓度降至＜0.01 mg/kg；施药后第14天土壤中阿维菌素的降解率也在90%以上，施药后21 d阿维菌素浓度降至＜0.01 mg/kg。由此可见，阿维菌素属于易消解农药，而且在罗汉果中的消解速率比在土壤上较快一些。

表4 阿维菌素在罗汉果和土壤中的消解动态

3 结论与讨论

此次研究以桂林特色农产品罗汉果和土壤为试验对象，以其种植过程中常用的农药阿维菌素为分析目标，确定50 mg C18+50 mg PSA作为最优的固相萃取填料方案，建立起超高效液相色谱法测定罗汉果和土壤中的阿维菌素残留量，用基质匹配外标法进行校正。该方法在0.05～5.0 mg/L质量浓度范围内具有良好的线性关系，平均回收率在84.9%～101.1%之间，SRSD为3.1%～9.8%，SLOQ均小于0.01 mg/kg，符合农药残留试验准则的要求[21]；通过上述建立的方法检测田间残留试验样品，由结果得知，阿维菌素在罗汉果与土壤中的残留量检出范围分别是0.029～0.305 mg/kg和0.092～ 0.984 mg/kg，均符合一级动力学消解方程，半衰期分别为1.9 d和4.4 d，并且分别在施药后第10和第21天质量浓度均降至＜0.01 mg/kg。由此可见，阿维菌素在罗汉果上的消解比在土壤上的速度快，对光热照射敏感，属于易消解农药（半衰期＜30 d）[22]。此次研究结果与阿维菌素在其他类似作物上的残留动态基本一致，例如：范文静等[12]研究得知阿维菌素在梨和土壤中的半衰期分别是1.3～3.0 d和1.2～3.7 d；李人杰等[23]试验发现玉米植株和土壤中的半衰期分别是0.73～2.25 d和1.65～2.76 d。综上所述，该检测方法快速、准确、灵敏，完全可以满足广西桂林特色农产品罗汉果及土壤中农药阿维菌素残留监测以及环境风险评价的技术要求。