漆黄素与β-环糊精衍生物的包合行为及性能研究

2021-08-24李燕华王淑慧李俊鹏李文琳

中草药 2021年16期

关键词：包合物环糊精黄素

李燕华，王淑慧，李俊鹏，李文琳，左川*，赵芳

·药剂与工艺·

漆黄素与β-环糊精衍生物的包合行为及性能研究

李燕华1，王淑慧2，李俊鹏1，李文琳1，左川1*，赵芳3*

1. 贵研铂业股份有限公司稀贵金属综合利用新技术国家重点实验室，云南昆明 650156 2. 云南民族大学化学与环境学院，云南昆明 650500 3. 洱源县检验检测院，云南大理 671200

制备漆黄素（fisetin，FIT）与β-环糊精衍生物的包合物，并对其包合行为和包合物的水溶性、稳定性进行研究。通过超声法制备了漆黄素与2-羟丙基-β-环糊精［(2-hydroxypropyl)-β-cyclodextrin，HP-β-CD］、2,6-二甲基-β-环糊精［(2,6-di--methyl)-β-cyclodextrin，DM-β-CD］和磺丁基醚-β-环糊精（sulfobutyl ether-β-cyclodextrin，SBE-β-CD）的包合物；采用核磁共振氢谱（1H-NMR和2D-NMR）、X射线粉末衍射（X-ray powder diffraction，XRD）、差示扫描量热法（differential scanning calorimetry，DSC）、扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）、紫外-可见光谱法（ultraviolet-visible spectrometry，UV）、Job曲线法对包合物进行表征；测定了包合物的水溶性，在模拟人体胃液和肠液环境下进行了稳定性的测试。核磁共振（1H-NMR和2D-NMR）分析表明，漆黄素从小口端进入HP-β-CD空腔，从大口端进入DM-β-CD和SBE-β-CD空腔。漆黄素与HP-β-CD、DM-β-CD和SBE-β-CD形成包合物后，其溶解度从0.05 mg/mL分别提高到了3.45、3.70、4.60 mg/mL。漆黄素与β-环糊精衍生物形成包合物后，其溶解度、热稳定性及生物环境稳定性得到明显提高。

漆黄素；β-环糊精；包合物；水溶性；稳定性；溶解度

漆黄素（fisetin，FIT）是黄酮类黄色针状结晶化合物，从漆树科植物木腊树(Sieb. et Zucc.) O. Kuntze中提取而来[1-2]，广布在蔬菜和水果中[3-4]。因其B环上具有邻二酚羟基的特殊结构使漆黄素具有较强的药理作用[5-8]，如抗病毒、治疗黄疽型病毒肝炎[9]；抑制细胞凋亡[10]、人黑色素瘤[11]、抗血管增生[12]、神经保护[13-14]、抗癌[15-16]等药理活性。尽管药物漆黄素在预防和治疗疾病中有显著的效果，但其较低的水溶性（溶解度小于1 mg/mL）[16]，化学不稳定性，脂溶性和溶出率低，代谢较快等性质限制了其药物制剂和临床应用[17]。

β-环糊精（β-cyclodextrins，β-CD）是由α-1,4-糖苷键键接的寡聚糖，具有亲脂空腔和亲水外壁，独特的理化性质使得环糊精分子可成功地作为药物载体[18-19]。在药物应用中，环糊精水溶性好且低毒、易降解，可改善药物的溶解性，提高制剂质量。本研究对药物漆黄素分子与2-羟丙基-β-环糊精［(2-hydroxypropyl)-β-cyclodextrin，HP-β-CD］、2,6-二甲基-β-环糊精［(2,6-di--methyl)-β-cyclodextrin，DM-β-CD］、磺丁基醚-β-环糊精（sulfobutyl ether-β- cyclodextrin，SBE-β-CD）包合物的水溶性和稳定性进行研究，为药物漆黄素的临床应用提供一条有效、低毒的新途径。

1 仪器与材料

1.1 仪器

UV-8453紫外-可见分光光谱仪，安捷伦科技有限公司；85-2恒温磁力搅拌器，江苏国华仪器有限公司；BSA224S-CW分析天平，Sartorius公司；FEI PHENO扫描电子显微镜（SEM），日本电子株式会社；TTR 18 kW转靶X-射线衍射仪，日本理学公司；Nicolet IS10红外光谱仪，美国Thermo科技有限公司；STA449F3热分析仪，德国耐驰公司；Bruker Avance 400 核磁共振仪，瑞士布鲁克公司。

1.2 材料

漆黄素（C15H10O6），相对分子质量（FW）＝286.23，质量分数＞98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；HP-β-CD（FW＝1 541.54）、DM-β-CD （FW＝1 331.36）和SBE-β-CD（FW＝1 451.29），北京百灵威科技有限公司，未经纯化直接使用；其余试剂均为分析纯试剂；所有实验用水均为超纯水。

2 方法

2.1 漆黄素/β-环糊精衍生物（FIT/β-CDs）物理混合物的制备

按物质的量比为1∶1称取漆黄素（0.01 mmol/L）和β-CDs（0.01 mmol/L）样品于玛瑙研钵中，加入少量水，研磨使其充分混合均匀，减压真空干燥，得到3种FIT/β-CDs（FIT/HP-β-CDs、FIT/ DM-β-CDs、FIT/SBE-β-CDs）物理混合物。

2.2 FIT/β-CDs包合物的制备

室温条件下，分别称取HP-β-CD（14.6 mg）、DM-β-CD（13.3 mg）、SBE-β-CD（11.4 mg）溶于4 mL蒸馏水，超声30 min后，逐滴加入用少量乙醇溶解的漆黄素（4.7 mg），40 ℃超声1 h后，冷却至室温，0 ℃避光放置2 d，除去反应液中乙醇，用0.45 μm微孔滤膜滤过，除去未反应的漆黄素，将滤液减压蒸干，得黄色固体粉末，真空干燥，分别得到FIT/HP-β-CD（产率74%）、FIT/DM-β-CD（产率80%）、FIT/SBE-β-CD（产率72%）包合物。

2.3 紫外光谱测定

紫外光谱测定使用Aglient 8453紫外-可见光谱仪，1 cm石英比色皿（1 cm×1 cm×4 cm）。实验测定：室温条件，溶剂为水-乙醇（4∶1），保持漆黄素的浓度为0.016 mmol/L，分批次加入β-CDs，静置15 min后进行紫外光谱测定（波长扫描范围220～800 nm），浓度梯度如表1所示。

2.4 线性关系考察

配制浓度为0.012、0.016、0.020、0.024、0.028、0.032、0.036、0.04、0.044、0.048 mmol/L的漆黄素对照品溶液，并在最大吸收波长365 nm处测得相应吸光度（）分别为0.268 1、0.336 1、0.425 5、0.511 9、0.574 1、0.660 5、0.747 9、0.820 3、0.891 2、0.969 9。以漆黄素溶液的浓度（）作横坐标，值为纵坐标绘制漆黄素的标准曲线，进行线性回归，得回归方程为＝19.65－0.030 99，为0.999 22，线性范围为0.012～0.048 mmol/L。

表1 紫外-可见光谱测定中在pH 3.0和pH 10.5条件下加入β-CDs衍生物的浓度变化

2.5 核磁共振测定

1H-NMR和二维ROESY使用瑞士Bruker公司Avance DRX 500 MHz核磁共振仪。将HP-β-CD、DM-β-CD、SBE-β-CD及FIT/HP-β-CD、FIT/DM- β-CD、FIT/SBE-β-CD溶于99.98% D2O中，滤过后于298 K下［以三甲基硅（TMS）为基准］测定核磁共振氢谱（1H-NMR）和二维核磁共振氢谱（2D-NMR）。

2.6 X射线粉末衍射（XRD）测定

XRD使用D/max-3B衍射仪；实验操作：Cu Kα（＝0.154 60 nm），40 kV，100 mA，2＝0.02°到 2＝3°～50°，速率5°/min；样品：漆黄素、HP-β-CD、DM-β-CD、SBE-β-CD、FIT/HP-β-CD、FIT/DM-β- CD、FIT/SBE- β-CD和3种FIT/β-CDs物理混合物。

2.7 热分析测定

分别取质量约为5～15 mg的漆黄素、HP-β- CD、DM-β-CD、SBE-β-CD及FIT/HP-β-CD、FIT/ DM-β-CD、FIT/SBE-β-CD样品，使用型号为德国耐驰公司的STA449F3进行热分析测定差示扫描量热（differential scanning calorimetry，DSC）曲线和热重分析（thermogravimetric analysis，TG）曲线。升温速率12 ℃/min，范围20～500 ℃，N2体积流量为70 mL/min。

2.8 SEM观察

SEM图通过FEI PHENO台式扫描电镜仪拍摄得到。测试条件：电子加速电压为20 kV，分辨率可放大700、1500、3000倍，甚至10 000倍；样品：漆黄素、HP-β-CD、DM-β-CD、SBE-β-CD、FIT/HP- β-CD、FIT/DM-β-CD、FIT/SBE-β-CD和3种FIT/β- CDs物理混合物。

2.9 包合率的测定

取FIT/HP-β-CD、FIT/DM-β-CD及FIT/SBE- β-CD包合物真空减压干燥（温度60 ℃），称适量的干燥物，加入2 mL蒸馏水，搅拌15 min，用0.45 μm滤膜过滤，取少许滤液稀释，摇匀于365 nm波长下测定值，代入“2.4”项中回归方程算出客体药物的含量，并计算出包合物FIT/HP-β-CD、FIT/ DM-β-CD及FIT/SBE-β-CD的包合物得率和包合率，实验重复3次。

2.10 水溶性实验

在室温pH 7.0的条件下，取过量的漆黄素、包合物FIT/HP-β-CD、FIT/DM-β-CD及FIT/SBE- β-CD，加入2 mL水，避光涡旋一段时间后用0.45 μm滤膜滤过除去未溶解物，减压旋蒸，得到黄色固体物，计算出该包合物与原药物漆黄素相比水溶性的增加量。

2.11 模拟生物体环境下的稳定性实验

取漆黄素、FIT/HP-β-CD、FIT/DM-β-CD及FIT/ SBE-β-CD包合物于25 mL棕色量瓶中，分别用pH 1.5和pH 7.6的2种缓冲溶液溶解（溶剂为水-乙醇4∶1），静置1 h至溶液平衡，固定波长为363 nm，药液作为对照，每隔（12±2）h对漆黄素的值进行跟踪测量。

3 结果与讨论

3.1 Job’s曲线的测定

确定化学计量比可采用等摩尔连续递变法，即Job法[20]。维持漆黄素和HP-β-CD的总浓度为0.08 mmol/L，在pH 3.0的缓冲溶液中分别配置一系列浓度的漆黄素和HP-β-CD混合液，然后在365 nm处测定值，使两者的物质的量之比（漆黄素的摩尔分数）在0～1内变化[21-22]。以值与漆黄素的摩尔分数作图，结果见图1，从曲线中可知最高点时相对应的横坐标为0.5。由此可确定主客体包合物FIT/HP-β-CD的包合化学计量比为1∶1。