麻杏止咳糖浆的薄层色谱法鉴别及高效液相色谱法测定其中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷

2021-08-24曹蓉蓉王文金严筱楠朱艳华

化学分析计量 2021年8期

曹蓉蓉，王文金，严筱楠，朱艳华

（榆林市药品检验所，陕西榆林 719000）

麻杏止咳糖浆收载于《中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂》第二十册［1］，是由麻黄、苦杏仁、甘草（炙）、石膏等4 味药材加工制成的复方制剂。麻黄作为麻杏止咳糖浆中的主药，有宣肺、解表之功效，与石膏相配，既能平喘，又能泻热；苦杏仁降肺气，助麻黄清肺平喘；甘草具有益气中和、生津止渴作用［2］。麻杏止咳糖浆现行质量标准中只有麻黄(盐酸麻黄碱)薄层色谱鉴别法，没有其它指标性成分的质控方法，不利于产品的质量控制。目前有人［3–6］使用高效液相色谱法测定麻黄止咳糖浆中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷等单一成分或几种有效成分的研究，但对指标成分进行定量测定，或对其它成分进行定性鉴别的研究鲜有报道。笔者在文献［3–17］方法的基础上，建立高效液相色谱法同时测定麻杏止咳糖浆中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷3种成分，并采用薄层色谱法定性鉴别甘草，为麻杏止咳糖浆的质量评价提供科学依据。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Agilent 1260型，配DAD检测器，安捷伦科技（中国）有限公司。

电子天平：（1）BP190S型，感量为0.1 mg，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；（2）MS205DU型，感量为0.01 mg，梅特勒–托利多仪器（上海）有限公司。

超声波清洗器：AS11000398型，天津奥特赛恩斯仪器有限公司。

自动纯水蒸馏器：LHP–18–2型，重庆力德高端水处理设备研发有限公司。

硅胶G板：美国Merck公司。

麻杏止咳糖浆样品：批号分别为1806001、1806002、1806003，陕西德福康制药有限公司。

甘草阴性样品：陕西德福康制药有限公司。

麻黄、苦杏仁阴性样品：陕西德福康制药有限公司。

盐酸麻黄碱对照品：纯度（质量分数）为100%，批号为171241–201809，中国食品药品检定研究院。

盐酸伪麻黄碱对照品：纯度（质量分数）为99.8%，批号为171237–201510，中国食品药品检定研究院。

苦杏仁苷对照品：纯度（质量分数）为88.2%，批号为110820–201808，中国食品药品检定研究院。

甘草酸单胺盐对照品：纯度（质量分数）为96.2%，批号为110731–202021，中国食品药品检定研究院。

甘草对照药材：批号为120904–201620，中国食品药品检定研究院。

乙腈：色谱纯，德国西格玛奥德里奇有限公司。

磷酸：优级纯，天津市科密欧化学试剂有限公司。

实验所用其它试剂均为分析纯。

实验用水为超纯水。

1.2 混合对照品溶液配制

取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷各10.00 mg于同一50 mL容量瓶中，用色谱流动相稀释至标线，摇匀，即得各组分质量浓度均为0.20 mg／mL的混合对照品溶液。

1.3 色谱条件

色谱柱：Phenyl-Ether柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美国安捷伦科技有限公司)；柱温：30℃；流动相：乙腈–0.02 mol／L磷酸溶液（含0.2%的三乙胺，用磷酸调节pH值至3.0）(体积比为5∶95），流量为1.0 mL／min；进样体积：20 μL；检测波长：210 nm；理论板数：按盐酸麻黄碱计算应不低于3 000。

1.4 样品处理

精密量取麻杏止咳糖浆样品10 mL于50 mL容量瓶中，加入色谱流动相30 mL，超声45 min，加入色谱流动相稀释至标线，摇匀，微孔滤膜滤过，作为样品溶液。

1.5 阴性样品处理办法

按照麻杏止咳糖浆处方工艺和处方量，制备未加甘草的对照样品和未加麻黄、苦杏仁的阴性样品，按样品溶液的制备方法分别制成不含甘草、麻黄、苦杏仁的阴性样品溶液。

2 结果与讨论

2.1 麻杏止咳糖浆中甘草成分的鉴别

参照中国药典2015年版一部［7］中的提取方法和展开条件，原方法加热提取时间较长，提取次数较多，造成试剂用量大、耗时长，故本试验通过使用不同提取溶剂，将加热回流改为超声提取，减少正丁醇提取次数，建立和优化的薄层色谱预处理方法，操作更加简便。具体方法：分别取3个批号的麻杏止咳糖浆20 mL，加乙醚40 mL，超声处理30 min，滤过，弃去醚液，向药渣中加入甲醇30 mL，超声处理30 min，滤过，将滤液蒸干，向残渣中加水40 mL使之溶解，用正丁醇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇提取液，用水洗涤2次，弃去洗涤液，将正丁醇提取液蒸干，向残渣中加入甲醇5 mL使之溶解，作为样品溶液。另取甘草对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。再取甘草酸单铵盐对照品，用甲醇溶解并稀释，制成质量浓度为2 mg／mL的溶液，作为对照品溶液。按照薄层色谱法（中国药典2015年版通则0502），吸取上述3种溶液各2 μL，分别点于用1%氢氧化钠溶液制备的同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯–甲酸–冰乙酸–水（体积比为15∶1∶1∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置于紫外光灯（365 nm）下检视。样品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置显示相同的橙黄色荧光斑点；阴性对照样品在此位置则没有斑点。该方法色谱斑点清晰、专属性较强，可作为本品中甘草的鉴别。

2.2 定量分析

2.2.1 色谱柱

参考中国药典中麻黄含量测定标准及相关参考文献［7–9］，分别考察了ZORBAX Eclipse XDB–C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Phenyl-Ether色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）两种色谱柱。试验结果表明：在同样使用乙腈和0.02 mol／L磷酸溶液（含0.2%的三乙胺，用磷酸调节pH值至3.0）的流动相体系之下，盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷3种成分在Phenyl-Ether色谱柱中可达到最佳分离效果，故本试验使用Phenyl-Ether色谱柱。

2.2.2 色谱流动相

分别采用不同体积比的甲醇–水、乙腈–水为流动相对样品进行分离，分离度均不能满足要求。参考文献［4，13，17］，分别选择乙晴–0.1%磷酸溶液（体积比为8∶92）、甲醇–水–乙酸（体积比为70∶28∶2）、乙腈–甲醇–0.1%磷酸溶液(体积比为4.5∶9∶86.5)、乙腈–0.02 mol／L磷酸（含0.2%的三乙胺，用磷酸调节pH值至3.0）（体积比为5∶95）4种流动相进行试验，结果表明，采用第4种流动相时，加入三乙胺使色谱峰形得到改善，拖尾减少，盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷3种成分色谱峰得到良好分离，分离度大于1.5，且保留时间适中，基线平稳，阴性对照样品无干扰峰出现。故选择乙腈–0.02 mol／L磷酸溶液（含0.2%的三乙胺，用磷酸调节pH值至3.0）（体积比为5∶95）为色谱流动相。

2.2.3 提取溶剂

盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷3种有效成分在不同溶剂内溶解性有很大的不同。分别以0.1%磷酸［3］、甲醇［4］、氨–乙醚［5］、盐酸–甲醇［12］，70%甲醇［16］、无水乙醇、色谱流动相为提取溶剂，对麻杏止咳糖浆样品进行提取试验，结果表明，采用色谱流动相提取样品时，盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷3种成分色谱峰与相邻峰可完全分离，且提取率较高，因此选择色谱流动相为提取溶剂。

2.2.4 样品处理方法

利用色谱流动相作为提取溶剂，分别采取超声15、30、45、60 min，加热回流30、60、90 min，超声30 min加回流30 min和不处理等方式进行样品处理试验，经含量测定发现，超声提取45 min后提取含量较高且不再增大，且超声提取方式比加热回流操作简单，提取时间更短，故选择超声提取45 min。

2.3 专属性试验

取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷对照品溶液，麻杏止咳糖浆样品溶液，及甘草、麻黄、苦杏仁的阴性样品溶液各适量，按1.3色谱条件进样测定。结果显示，各色谱峰分离良好，理论板数按盐酸麻黄碱计算大于3 000，阴性样品在盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷对照品相应色谱峰位置未检出色谱峰。表明本方法系统适用性及专属性均良好。色谱图见图1。

图1 样品、对照品、阴性样品溶液色谱图

2.4 线性关系考察

分别精密量取1.2所配制的混合对照品溶液5、10、15、20、25、30 μL，在1.3色谱条件下进行测定，以进样质量（X，μg）为横坐标、对应色谱峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷的线性方程分别为Y=242.76X+25.63 3，Y=256.39X+12.727，Y=103.34X–19.34，线性相关系数分别为0.999 9、0.999 6、0.999 2，线性范围分别为1.056～6.336 μg，1.003～6.018 μg，0.889～5.334 μg。

2.5 方法精密度

取同一批号麻杏止咳糖浆样品6份（批号：1806001），按1.4方法制备成样品溶液，在1.3色谱条件下进行测定，测定结果列于表1。由表1可知，样品中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷含量测定结果的相对标准偏差分别为1.5%、1.8%、1.6%，表明本方法重复性精密度良好。

表1 精密度试验结果

2.6 稳定性试验

取新制备的麻杏止咳糖浆样品溶液（批号：1806001），于溶液配制后0、2、4、6、8 h按照本方法测定盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱和苦杏仁苷，记录色谱峰面积，计算测定结果的相对标准偏差，结果列于表2。由表2可知，样品溶液配制8 h内盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱和苦杏仁苷测定结果的相对标准偏差分别为1.1%、2.0%、1.6%，表明溶液在8 h内稳定。