叉头框蛋白A1表达与结直肠癌临床病理特征的相关性研究

蒋 振，汪露祥，吴献忠

结直肠癌是世界范围内发病率及死亡率较高的恶性肿瘤，是癌症相关死亡率的第4大诱因[1]。虽然诊疗技术的提高、早期诊断和使用分子靶向疗法可有效改善结直肠癌患者的临床结局，但患者的预后仍较差，5年生存率低[2]。目前TNM分期等被用于预测结直肠癌预后，但特异度不高，对结直肠癌分子生物学研究可提高对肿瘤异质性认识和寻找预后标志物[3]。叉头框蛋白A1（FOXA1）属于FOX基因超家族，可通过诱导核小体重排和改变，来调节转录程序，在多种生物学过程中发挥重要作用，如细胞增殖、凋亡和分化等[4]。其在肿瘤进展中的作用近年来也被逐渐重视。研究证实，FOXA1在多种实体肿瘤中上调，并促进肿瘤生长和转移，如乳腺癌、子宫内膜癌、胃癌等[5-7]。FOXA1在多种类型的癌症中起抑癌基因或癌基因的作用。然而，FOXA1在大肠癌中的独特功能尚不清楚，且相关研究报道较少，本研究选取配对癌组织及癌旁组织检测FOXA1表达，并分析其临床意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2017年1月—2019年1月在我院行结直肠癌根治术的患者100例，男56例，女44例；年龄39～78岁，平均（57.1±6.8）岁。TNM分期：Ⅰ期21例，Ⅱ期40例，Ⅲ期39例；淋巴结转移39例；脉管浸润30例。选择标准：经病理确诊为结肠腺癌或直肠腺癌；根据第8版ACJJ中肿瘤分期标准，TNM分期均为Ⅰ～Ⅲ期；术前影像学检查提示肿瘤无远处转移；术前未接受化疗、放疗、免疫治疗等抗肿瘤治疗；术后获得癌组织标本及癌旁组织标本；签署研究同意书。排除标准：转移、复发者；转移性结直肠癌；存在其他肿瘤、精神疾病、自身免疫性疾病、感染性疾病及其他胃肠道疾病者。

1.2 免疫组织化学法检测FOXA1表达情况 取癌组织、癌旁组织（为距离肿瘤边缘>5 cm的正常组织)标本，大小为2.0 cm×0.5 cm×0.3 cm，室温下将标本浸入10%中性福尔马林缓冲液中固定12～24 h。石蜡包埋在，连续切成5 µm切片。将切片在二甲苯中脱蜡，用梯度乙醇进行水化。用EDTA（pH值为8.0）对组织玻片进行抗原修复10 min。然后将样品与抗FOXA1(EP277兔单抗，购自北京中杉金桥生物技术有限公司）在4 ℃下孵育过夜。使用PV-9000二步法检测试剂盒（购自北京中杉金桥生物技术有限公司）进行免疫染色。由我院病理科两位高年资医师共同阅片，判断标准：1）染色强度得分：浅黄色为1分，黄色为2分，深黄色为3分；2）染色程度得分：1分 6%～25%，2分 26%～50%，3分 51%～75%，4分>75%。将上述两项得分相乘，其积≤2分为阴性，>2分为阳性。

1.3 随访方法 手术时间为开始随访时间，随访终点为死亡，随访截止时间2020年4月，总生存期（overall survival，OS）指随访开始时间与随访截止时间或死亡时间的间隔。

1.4 统计学方法 使用SPSS 23.0软件进行统计学分析，计数资料以例（%）表示，比较采用χ2检验，使用Kaplan-Meier法和Log-rank法分析FOXA1表达对OS影响，使用COX回归分析患者OS的影响因素。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FOXA1表达情况 癌组织中60例FOXA1表达阳性（图1），癌旁组织中32例FOXA1表达阳性（图2），癌组织中FOXA1表达阳性率高于癌旁组织（60.0% vs 32.0%，χ2=15.781，P<0.001），见表 1。

图1 癌组织中FOXA1表达阳性

图2 癌旁组织中FOXA1表达阳性

表1 癌组织和癌旁组织中FOXA1表达情况

2.2 临床病理因素与FOXA1表达的关系FOXA1表达阳性组的TNM Ⅲ期、中低分化、淋巴结转移、脉管浸润率高于FOXA1表达阴性组，差异有统计学意义（均P<0.05），两组间肿瘤最大直径、年龄、性别差异无统计学意义（P>0.05），见表2。

表2 临床病理因素与FOXA1表达的关系

2.3 FOXA1表达与OS的关系 随访16～40个月，中位随访时间27个月，失访7例，成功随访率为93%，共死亡13例。FOXA1表达阳性组的累积生存率低于FOXA1表达阴性组（Log-rank χ2=4.085，P=0.391），见图 3。

图3 FOXA1表达阳性与阳性患者的生存曲线

2.4 结直肠癌OS的影响因素分析 单因素COX回归分析显示，FOXA1表达、TNM分期、分化程度、淋巴结转移、脉管浸润是结直肠癌OS的影响因素（P<0.05），见表3。多因素COX回归分析显示，FOXA1阳性表达、TNM分期为Ⅲ期、淋巴结转移、脉管浸润是结直肠癌OS的独立危险因素(P<0.05)，见表4。

表4 结直肠癌OS多因素分析

3 讨论

FOXA1是FOXA相关家族的三个成员之一，也称为肝细胞核因子α，可以结合与代谢过程、信号通路和细胞周期相关的100多个基因的启动子，此外FOXA1还能调节雄激素和雌激素受体活性，起核甾体受体信号转导的关键介质的作用[8]。FOXA1在多种器官中表达，包括乳房、肝脏、胰腺、膀胱、前列腺、结肠和肺，在调节核类固醇受体活性中起主要作用，尤其是在乳腺癌和前列腺癌中，并且可能促成促肿瘤表型[9]。由于其在细胞生长调控过程中的关键作用，研究人员已开始确定其在人类癌症中的功能意义。在胰腺癌、前列腺癌和肺癌中已证实FOXA1表达升高[10-12]。功能方面，其可促进乳腺癌、前列腺癌等多种癌细胞生长、浸润和转移[5,12]。但是目前为止，FOXA1在结直肠癌中的表达和生物学功能尚未阐明。

本研究结果显示，癌组织中FOXA1表达阳性率高于癌旁组织，提示结直肠癌中FOXA1表达上调，此外FOXA1表达阳性患者更容易出现高TNM分期、中低分化癌及淋巴结转移、脉管浸润，提示结直肠癌中FOXA1表达与较差的临床病理特征有关，说明FOXA1可能与结直肠癌的发展和进程有关。预后研究也证实FOXA1表达阳性组累积生存率更低，FOXA1表达阳性是结直肠癌生存的独立危险因素。Park等[9]研究显示，403例大肠癌患者中FOXA1过表达，且FOXA1过度表达与分化、淋巴管浸润、肿瘤晚期、浸润深度、淋巴结转移和生存率差有关，与本研究结果相符。Ma等[13]在结直肠癌组织中检测到FOXA1的mRNA和蛋白表达显著升高，还发现FOXA1的阳性表达可能是预测不良预后的潜在因素。目前体外实验证明，FOXA1的抑制可抑制结直肠癌细胞的增殖并诱导其凋亡[14]。上述研究均证实FOXA1作为促癌因子，在结直肠癌进展中发挥重要作用。

FOXA1表达在结直肠癌中作用机制尚不清楚。Hippo河马途径是结直肠癌细胞增殖、生长和细胞凋亡的重要调节途径，FOXA1通过影响YAP（被认为是结直肠癌的治疗靶标）来影响Hippo河马途径是目前被广泛认可的作用机制[15]。FOXA1对YAP表达有积极作用，YAP启动子内cAMP反应元件结合蛋白（CREB）结合位点周围的FOXA1致密染色质的开放促进了CREB介导的YAP转录[16]。由FOXA1介导的CYR61增强子激活可促进结直肠癌细胞迁移，抑制FOXA1可抑制细胞迁移[17]。多项研究证实了FOXA1通过调节Hippo河马途径来调节结直肠癌细胞增殖和凋亡[15-17]。结直肠癌的转移和侵袭是涉及多种途径的复杂过程，FOXA1对结直肠癌进展的影响机制仍需进一步研究。

本研究证实FOXA1与结直肠癌的发展和进程有关，FOXA1在结直肠癌组织中表达上调，其与较差的临床病理特征有关，FOXA1高表达的结直肠癌患者预后较差。但本研究存在许多局限，如病例数、随访时间有限，此外仅采用免疫组织化学法检测FOXA1表达情况，未对FOXA1表达进行定量研究等，研究仍待进一步完善。