杧果SC-SSR分子标记反应体系的建立与优化

覃昱茗 张宇 黄国弟 莫永龙 罗世杏 荣涛

摘 要：采用正交设计方法，对影响PCR反应体系的5个因素（Mg2+、Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物和模板DNA）进行了优化，建立了适用于杧果的SC-SSR-PCR反应体系。结果表明，总反应体系25 μL中，包含模板DNA用量100 ng·mL-1、Mg2+浓度2.00 mmol·L-1、引物浓度0.40 μmol·L-1、Taq DNA 聚合酶浓度1.00 U、dNTPs浓度0.15 mmol·L-1。利用优化的杧果SC-SSR-PCR反应体系对10对SC-SSR引物进行验证，均能扩增出清晰、明亮、特异的电泳条带。因此，优化的杧果SC-SSR-PCR反应体系适用于杧果种质鉴定和亲缘关系分析。

关键词：杧果 SC-SSR 正交设计 体系优化

中图分类号：S667.7           文献标识码：A

杧果（Mangifera indica L.）为漆树科重要常绿经济果树，原产印度，其果实风味极佳[1]。国内海南、广东、广西、福建、云南、贵州、四川均有栽培[2-3]。起始密码子-微卫星扩增多态性（start codon simple sequence repeat，SC-SSR）标记是郭大龙等结合SCoT和ISSR分子标记技术开发出来的一种既能将标记位点与表达序列紧密联系，又具有相对较高多态性的新型分子标记[4]。目前，SC-SSR标记已应用于猕猴桃遗传多态性分析及其指纹图谱构建，但在其他物种中的应用研究在国内并不多[5]。

由于杧果高度异花授粉，种子高度杂合，且生产交易中往往存在同物异名和异物同名等问题，给杧果育种工作带来了诸多阻碍[6-8]。SC-SSR分子标记在种质鉴定方面具有独特的优势，但在杧果中尚未有报道。基于这些问题，本研究较全面地建立并优化杧果的SC-SSR反应体系，为其在杧果种质资源评价、遗传多样性分析等领域的应用提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

5份杧果材料（表1）采集自广西大学农学院果树种质资源圃。所用的10条SCoT引物和10条ISSR引物（表2）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。dNTPs、Taq DNA聚合酶、DNA marker购买于北京天根生化科技有限公司。

实验仪器：凝胶成像系统（Bio-rad Geldoc XRt）、三恒电泳仪（HAD-JY600C）、Eppendorf离心机5810R、超微量分光光度计、Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler PCR仪。

1.2 基因组DNA提取及质量检测

选取健康无病虫侵害以及机械损伤的杧果绿色嫩叶，放入冰盒中迅速带回实验室，采用植物DNA提取试剂盒（DNA secure plant Kit，天根生化科技北京有限公司）获取芒果基因组DNA，通过测定230 nm、260 nm和280 nm波长下的OD值和琼脂糖凝胶电泳成像检测DNA的纯度和浓度，保存于-30℃冰箱以备后续研究。

1.3 正交试验确定SC-SSR-PCR反应体系

参考杧果CDDP-PCR反应体系研究的方法[7]，设计5因素4水平的L16（45）正交优化试验方案（表3）。5因素分别为：Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物和模板DNA。该试验设计方案共产生16个处理，每个处理做3次重复，各处理总体系均为25 μL。根据琼脂糖凝胶电泳的扩增结果对每个处理结果进行打分，打分范围1-16，打分标准为条带清晰度、整齐度、明亮度、丰富性、特异性[9]。打分结果用SPSS  10.0软件进行统计分析。

1.4 SC-SSR-PCR优化体系的确认与验证

PCR扩增程序为：95 ℃预变性5 min;前2个循环：95 ℃变性1 min，40 ℃退火1 min，72 ℃延伸100 s;后28个循环：95 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸100 s;最后72 ℃延伸8 min。將扩增产物在1.5%质量浓度的琼脂糖凝胶中电泳，并在凝胶成像仪内拍照，分析图片。根据上述试验结果确定SC-SSR-PCR的最佳反应体系，随机选用10个组合对5份杧果材料进行PCR扩增，从而进一步确证最优的杧果SC-SSR-PCR扩增体系。

2 结果与分析

2.1 正交试验结果分析

以ISSR引物807和SCoT引物SC8作为组合引物为例，进行16个处理的SC-SSR-PCR扩增，结果差别较大。处理1肉眼可见的扩增条带只有一条，处理11、12、14扩增出的条带数量多、亮度高且条带整齐，扩增效果较为理想;其余处理也可以扩增出多条条带，但整齐度和亮度远不及处理11、12、14所得结果。

2.2 5个因素对SC-SSR-PCR反应的影响分析

依据表3的评分结果进行统计分析，最终得到各因素的平均值和极差值，结果见表4。其中极差R值是反映某一因素对该反应体系构建影响的强弱，R越大代表该因素对PCR结果影响越大。由表4可知，该反应体系中5因素对PCR结果影响强弱的最终排序是模板DNA>Mg2+>引物>Taq DNA 聚合酶>dNTPs。通过差异显著性分析表明，模板DNA与其他的4个因素存在显著差异;Mg2 +和引物之间差异不显著，Taq DNA 聚合酶和dNTPs之间差异不显著。

表5结合表3数据分析可知，DNA模板用量为100 ng和135 ng时，对试验结果无显著差异，但与65 ng、30 ng用量相比存在显著差异;Mg2+浓度为1.50 mmol·L-1和2.0 mmol·L-1时，对试验结果无显著差异，但与1.0 mmol·L-1、2.5 mmol·L-1浓度相比存在显著差异;引物浓度为0.60 μmol·L-1和1.00 μmol·L-1时，对试验结果无显著差异，但引物浓度为0.4 μmol·L-1、0.80 μmol·L-1时，对试验结果存在显著差异;Taq DNA聚合酶用量为0.25 U和1.00 U时，对试验结果无显著差异，但与0.50 U、0.75 U用量相对比存在显著差异;dNTPs浓度仅为0.10 mmol·L-1时，与其它3个浓度水平存在差异显著，而其它3个浓度水平之间差异不显著。

T1～T4，每一因素同一水平下的打分总和;不同的小写字母表示总分的差异显著（P<0.05） ，T1～T4分别与表3中的（1）～（4）对应。

2.3 SC-SSR-PCR反应体系稳定性验证

根据正交试验设计的优化结果，选用10对SC-SSR标记引物（表2，每行引物一一对应）分别对5份杧果材料进行SC-SSR扩增，以验证该体系在不同引物组合下的稳定性。由图2可知，10对SC-SSR引物均可以扩增出清晰明亮的琼脂糖凝胶电泳条带，只是不同的SC-SSR引物扩增出的共有性和特异性条带数量有所不同，其中共有性条带表现了杧果种内的稳定遗传性，特异性条带体现了品种间的遗传差异，表明该优化体系以及引物适用于杧果SC-SSR-PCR分析。

3 结论与讨论

与单因素多水平逐级优化法相比，正交优化分析法将反应体系内不同因素之间的相互影响考虑入内，大大降低了只针对某一因素确定最佳浓度或用量的片面性[10-16]。正交优化试验设计除了考虑到各因素之间的综合效应，同时兼具省时、省力的特点优势[17-18]。

房志超对杧果ISSR反应体系的建立进行了优化，运用L16（45）正交设计对杧果ISSR反应的模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物和Taq DNA聚合酶在4个水平上进行优化试验，总反应体系25 μL，结果发现影响杧果ISSR-PCR反应的因素从大到小依次为：模板Mg2+>引物>Taq DNA 聚合酶>dNTPs>DNA[19];而表4结果显示影响杧果SC-SSR-PCR反应的因素从大到小依次为：模板DNA>Mg2 +>引物>Taq DNA 聚合酶>dNTPs;这有可能是因为SC-SSR是基于雙引物开发出的分子标记技术，双引物需要更精准地与模板DNA进行锚定，需要的模板DNA用量显得尤为重要，而ISSR标记是随机分子标记，较少的模板DNA用量进行PCR扩增即可表现出丰富的遗传多样性条带，因而造成了各影响因素的重要性不尽相同。目前在杧果中尚未发现SCoT反应体系建立优化的相关报道，但是在其它多年生木本果树中已出现相关研究报道。在荔枝中，5个因素对PCR反应体系的影响由大倒小依次为：dNTPs>Mg2 +>模板DNA>引物>Taq DNA 聚合酶[20];在榴莲蜜中，各因素在不同水平的变化对PCR反应体系的影响为：dNTPs>引物>Mg2 +>Taq DNA 聚合酶>模板DNA[21]。上述研究表明，在荔枝和榴莲蜜中进行SCoT反应体系建立与优化，dNTPs都是对SCoT反应体系建立影响最大的因素，这很有可能是因为在进行SCoT-PCR扩增时，需要经过更为复杂地反应扩增程序，模板DNA需要不断的进行双螺旋结构的分解、复制过程，需要大量的碱基原材料才能完成完善上述PCR扩增，需要dNTPs提供PCR反应进行的大量原材料，因此dNTPs成为影响SCoT反应体系建立与优化最重要的因素。

依据笔者研究结果分析得出较为理想的SC-SSR-PCR反应体系的建立可以选择模板DNA的用量为100 ng或135 ng，表5显示100 ng和135 ng模板DNA用量对SC-SSR-PCR反应体系的建立结果影响无显著差异，本着节约原则，可选用100 ng模板DNA用量;由正交试验L16（45）设计以及PCR凝胶电泳分析得出较为理想的SC-SSR-PCR反应体系的建立可以选择Mg2 +浓度2.00 mmol·L-1或2.50 mmol·L-1，但表5显示2.00 mmol·L-1和2.50 mmol·L-1Mg2 +浓度对SC-SSR- PCR反应体系的建立结果影响有显著差异，因此Mg2+ 浓度选择待定;依据Mg2 +浓度选择的分析原理，SC-SSR-PCR反应体系的建立可以选择引物浓度为0.40 μmol·L-1或0.60 μmol·L-1，但表5显示0.40 μmol·L-1和0.60 μmol·L-1引物浓度对SC-SSR-PCR反应体系的建立结果影响有显著差异，因此引物浓度选择待定;Taq DNA聚合酶用量也采用同样的分析原则，较为理想的SC-SSR-PCR反应体系的建立可以选择Taq DNA聚合酶用量0.50 U或0.75 U或1.00 U，但表5显示0.50 U、0.75 U和1.00 U Taq DNA聚合酶用量对SC-SSR-PCR反应体系的建立结果影响有显著差异，因此Taq DNA聚合酶用量选择待定;SC-SSR-PCR反应体系的建立可以选择dNTPs浓度0.10 mmol·L-1或0.15 mmol·L-1或0.20 mmol·L-1，但表5显示0.15 mmol·L-1和0.20 mmol·L-1dNTPs浓度对SC-SSR-PCR反应体系的建立结果影响无显著差异，而0.10 mmol·L-1dNTPs浓度与0.15 mmol·L-1和0.20 mmol·L-1 dNTPs浓度对SC-SSR-PCR反应体系的建立结果影响有显著差异，本着节约原则dNTPs浓度在0.10 mmol·L-1和0.15 mmol·L-1之间做选择。上述分析可以明确模板DNA用量为100 ng，凝胶电泳显示处理11、12和14可以扩增出清晰、层次分明的条带，而只有处理12的模板DNA用量确定为100 ng，由此做出模板DNA用量100 ng·mL-1、Mg2+浓度2.00 mmol·L-1、引物浓度0.40 μmol·L-1、Taq DNA 聚合酶浓度1.00 U、dNTPs浓度0.15mmol·L-1的各组分浓度组合选择。

依据上述分析，可以判断反应体系内5因素对PCR结果影响强弱的最终排序是：模板DNA>Mg2+>引物>Taq DNA 聚合酶>dNTPs。正交反应体系各因素的最佳浓度或用量组合是：模板DNA用量100 ng·mL-1、Mg2 +浓度2.00 mmol·L-1、引物浓度0.40 μmol·L-1、Taq DNA 聚合酶浓度1.00 U、dNTPs浓度0.15 mmol·L-1。10对SC-SSR引物均能扩增出条带整洁、主次分明、特异丰富的凝胶电泳结果，表明SC-SSR引物以及反应体系适用于杧果的亲缘关系分析。

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