黑龙江省大白菜黑腐病病原菌的分离与鉴定

孟雪娇 史庆馨 许春梅 冯一新 高永利 沙春艳 陈立新

摘    要：十字花科蔬菜黑腐病是由野油菜黄单胞菌野油菜致病变种引起的世界性的重要病害之一。近年来，黑龙江省大白菜黑腐病增加，因此有必要对其进行研究。以黑龙江省哈尔滨市和依兰县感染黑腐病的大白菜叶片为试材，分离纯化病原菌，获得3株病原菌。应用分子生物学方法鉴定病原菌，以细菌通用引物16S rRNA对该病原菌进行16S rRNA的PCR扩增测序分析，发现该病原菌均与Xanthomonas campestris pv. campestris 具有分别为99.71%、100.00%和99.93%的一致性。根据分离菌的表型特征及分子特征，鉴定分离的病原菌为大白菜黑腐病的致病菌-野油菜黄单胞菌野油菜致病变种。

关键词：大白菜;黑腐病;野油菜黄单胞菌野油菜致病变种;黑龙江

中图分类号：S634.1 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2021）07-020-05

Isolation and identification of pathogenic bacteria of black rot in Chinese cabbage in Heilongjiang

MENG Xuejiao1，2， SHI Qingxin2， XU Chunmei2， FENG Yixin2， GAO Yongli2， SHA Chunyan2， CHEN Lixin2

（1. Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences Postdoctoral Programme， Harbin 150086， Heilongjiang， China; 2. Horticultural Sub-academy， Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences， Harbin 150069， Heilongjiang， China）

Abstract： The black rot of cruciferous vegetable caused by Xanthomonas campestris pv. campestris is one of the most important diseases in the world. In recently years， the incidence of black rot of the chinese cabbage has increased in Heilongjiang Province， therefore， pathogen was isolated and identified. The leaves of Chinese cabbage infected by black rot were used as test materials in Yilan county and Haerbin city in Heilongjiang province. The pathogens were isolated and purified， and three pathogenic strains were obtained. The pathogenic bacterias were identified by molecular biological methods， their 16S rRNA were amplified by PCR with the universal primer 16S. It was found that the sequences of pathogens were 99.71%， 100.00%， and 99.93% consistent with that of Xanthomonas campestris pv. campestris， respectively. The isolated strain were identified as Xanthomonas campestris pv. campestris based on their phenotepic and molecular characteristics.

Key words： Chinese cabbage; Black rot; Xanthomonas campestris pv. campestris; Heilongjiang

黑腐病主要危害十字花科蔬菜叶片、叶球和球茎，十字花科蔬菜黑腐病是由野油菜黄单胞菌野油菜致病变种[Xanthomonas campestris pv. campestris （Pam.） Dowson]引起的世界性的重要病害之一[1]。黑腐病的寄主范圍相当广泛，主要危害甘蓝[2-4]、结球白菜[3，5]、不结球白菜[3，5]等。大白菜幼苗期即可发病，但以成株发病为主。

由于气候条件变化、多茬栽培和国外春大白菜品种的引进，黑腐病对蔬菜生产的威胁日趋扩大。20世纪80 年代全国各地已经普遍流行，北起黑龙江、南至海南岛均有分布，大白菜的产量受到很大损失，且品质受到很大影响[6-8]。因此，黑腐病不仅是世界、也是我国大白菜的主要病害之一[9]。

国内对黑腐病菌的研究主要有：芦燕[8]对陕西省大白菜黑腐病病原菌及抗病性进行鉴定;解永梅等[10-11]对山东省大白菜黑腐病的研究，分别在细胞和分子水平上完成了山东省地区的病原菌鉴定，完善了相对应的抗病性鉴定方法研究，证明了存在致病型分化，并进行了抗性资源的筛选等;郑学立等[12]对福建地区不结球白菜黑腐病菌进行分离与初步鉴定;翟文慧等[13]进行了大白菜黑腐病鉴定的湿度试验及其苗期与成株期抗病性的相关分析研究，发现苗期与成株期抗病性呈显著线性关系，说明用苗期人工接种的方法鉴定大白菜黑腐病抗性是可靠的，可以缩短研究时间。其他十字花科蔬菜，如甘蓝、青花菜、萝卜等的黑腐病研究相对较多。如张玉勋等[14]对970份萝卜种质资源进行了抗黑腐病鉴定，其中3份表现抗性强，867份皆表现不抗病;黄德芬等[15]对甘蓝黑腐病离体鉴定方法进行研究;曹建琴等[16]对15个甘蓝品种进行不同生育期抗黑腐病田间调查，发现对甘蓝黑腐病进行药物防治应重点选择在莲座期至收获期;刘莉莉等[17]对青花菜黑腐病菌分离和鉴定;朱平川等[18]用剪叶接种法对广西十字花科黑腐病菌（Xanthomonas campestris pv. campestris， XCC）进行致病性分析，并应用细菌基因组的重复序列PCR （Rep-PCR）技术进行遗传多样性研究，发现侵染广西十字花科黑腐病菌存在明显的致病性分化和丰富的遗传多样性。

国外对黑腐病的研究相对较多，包括生理小种的划分、转录组学和蛋白质组学的研究等等。如2007年XCC被分为9个生理小种[19]，而到现在为止XCC被分为11个生理小种[20]。对十字花科黑腐病转录组的研究发现，prc基因，即XCC致病机制相关的特殊蛋白酶发生转位子突变，引起毒性及胞外蛋白质产量降低，RNA-Seq发现91个差异表达基因，这些基因主要参与碳水化合物转运和代谢、细胞壁/细胞膜生成、翻译后修饰、蛋白周转和分子伴侣、无机离子转运和代谢以及信号转导机制[21]。关于野油菜黄单胞菌野油菜致病变种与寄主甘蓝（Brassica oleracea）易感品种内源表达的蛋白质组学的报道是在2008年，应用双向电泳结合肽指纹图谱或从头测序技术，对未来的研究分析非常有用，进而发展为新策略来控制这个非常重要的植物病原体[22]。Santos等[23]应用label-free shotgun 2D-nanoUPLC/MSE分析XCC蛋白与易感植物、抗性植物共生及培养基（对照）中情况，并应用qPCR方法确定被选择的一些基因的差异表达情况，主要研究病菌的致病性机制。

近几年，笔者及所在单位科研工作者在田间调查时发现，黑龙江省的大白菜黑腐病越来越严重，所以，迫切需要解决这个问题，有必要加强对其进行研究[24]。在参照芦燕[8]方法的基础上，笔者通过采集大白菜黑腐病样叶片，分离、纯化并鉴定黑腐病菌，获得黑腐病菌部分基因序列，为后续的研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试黑腐病叶片2017年采集于黑龙江省依兰县农民白菜地，2018年采集于黑龙江省农业科学院园艺分院试验田，材料分别为586（哈尔滨刘元凯种业有限公司育成的品种）和龙园红4号（黑龙江省农业科学院园艺分院育成的橘红心品种）。

牛肉膏蛋白胨固体培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化钠 5 g，琼脂粉20 g，纯化水1000 mL，121 ℃灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离 分别于2017年和2018年10月份在黑龙江省农业科学院园艺分院公共实验室进行病原菌的分离。2017年从黑龙江省依兰县和2018年从黑龙江省哈尔滨市采集大白菜黑腐病病样，在牛肉膏蛋白胨固体培养基上采用平板划线法进行分离、纯化。具体步骤如下：在操净工作台上，黑腐病叶片的病健交界处取5 mm×5 mm的叶片，用75%酒精浸泡15 s，重复1遍，之后再用无菌水冲洗1遍，最后，用无菌镊子将冲洗过的叶片放在牛肉膏蛋白胨固体培养基上，28 ℃恒温培养2 d，从培养皿上挑取细菌接到新培养基皿中（划Z字形），待其恒温培养，之后挑取单菌落，继续进行纯化。

1.2.2 病原菌致病性测定 黑腐病菌经活化后，用牛肉膏蛋白胨液体培养基于空气摇床内28 ℃振荡培养18 h，之后用小型喷壶用喷雾法接种到4～5叶期健康的大白菜叶片上[12]，26 ℃气候培养箱中保湿培养2 d，观察其发病情况。

1.2.3 病原菌分子生物学测定 菌株于牛肉膏蛋白胨液体培养基中28 ℃振荡培养至对数生长期，以12 000 r·min-1 离心，收集菌体，采取SDS方法提取基因组DNA，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。由北京六合华大基因科技有限公司合成细菌通用引物16 s，用于扩增。16 s引物序列：27f：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG;1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT。

PCR反应体系：总体积30 μL，反应液为DNA 模板 1 μL，引物各 3 μL，dNTP 2 μL，Buffer 3 μL，酶 0.2 μL，H2O 17.8 μL。PCR反应条件如下：95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35循环;72 ℃ 10 min;4 ℃保存。0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。将样品送至北京六合华大基因科技有限公司进行测序。测序所得序列在GenBank数据库中进行同源比对，用MEGA6.0软件构建Neighborhood-joining系统发育树。

2 结果与分析

2.1 黑腐病病样

黑腐病菌從大白菜叶缘的水孔侵入后先形成三角形褪绿黄斑，叶缘产生黄褐色坏死斑，再沿叶脉蔓延，逐渐扩大成“V”字形或长条形黄褐斑，周边伴有黄色褪绿晕带，该部叶脉坏死变黑（图1）。

2.2 病原菌的分离与纯化

采用平板划线法在牛肉膏蛋白胨培养基上进行病原菌的分离与纯化。发现菌在牛肉膏琼脂培养基上初期呈淡黄色，后期变蜡黄色，形成黏稠状近圆形菌落（图2），共获得3个菌株，分别为yian、harbin1、harbin2，其中2017年获得1株，2018年获得2株。

2.3 病原菌的致病性测定

将纯化后的黑腐病菌于牛肉膏蛋白胨液体培养基中培养，大白菜叶片保湿48 h后接种黑腐病菌 48 h，发现3个菌株引起的症状与黑腐病均一致（图3）。

2.4 病原菌的分子生物学鉴定

PCR扩增产物（图4），经测序分别得到长1417、1327、1396 bp碱基序列，经NCBI BLAST （http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/blast） 网上比对，这3个菌株与已报道的野油菜葡萄球菌致病变种保守序列一致性分别为99.71%、100.00%和99.93%，证明分离纯化的病原菌即为野油菜黄单胞菌野油菜致病变种。并用MEGA6.0软件进行序列比对，构建系统发育树（图5）。

3 讨论与结论

因大白菜黑腐病的发病面积较以往逐渐增加，引起关注。笔者通过采集两年黑龙江省大白菜黑腐病样，获得了黑龙江省部分地区的大白菜黑腐病菌序列，序列比对结果说明分离纯化的黑腐病菌均为野油菜黄单胞菌野油菜致病变种，确定引起黑龙江省大白菜黑腐病的病原菌均为野油菜黄单胞菌野油菜致病变种，与卢燕[8]研究结果相同，说明野油菜黄单胞菌野油菜致病变种引发了大白菜黑腐病。

2017年，Cruz等[20]将XCC划分为11个生理小种。近几年，基于参考基因组开发的特异性生理小种标记研究也已开展，2018年，首次报道开发了3个关于Xcc race3的标记XccR3-49、XccR3-52和XccR3-55[25]，且在2017年，同研究组也报道了关于Xcc race1和Xcc race4的分子标记[26]，这些为快速检测和鉴定黑腐病菌提供了分子生物学手段。笔者在本研究中分离了3株黑腐病菌，黑龙江省地区黑腐病是否还有其他致病型，还有待于继续研究，且可以借助特异性生理小种标记技术快速检测黑腐病菌。

本试验为以后的研究奠定了基础，笔者将不断深入对大白菜黑腐病的研究，如应用蛋白质组学等技术分析大白菜抗黑腐病的可能机制，为科学鉴定抗黑腐病种质资源提供依据及快速准确的实验手段，同时对缩短抗性品种的选育时间、推动抗黑腐病育种进程等具有重要的科学意义。从生态、效益等方面考虑，选育抗性品种并加以利用，减少黑腐病发病面积，会减少农药的使用，减轻农药对生态环境的破坏;另一方面，会减少资金投入，因此，可带来更多的经济和社会效益。

参考文献

[1] WILLIAMS P H，STAUB T，SUTTON J C.Inheritance of resistance in cabbage to black rot[J].Phytopathology，1972，62（2）： 247-252.

[2] 肖崇刚.一种甘蓝黑腐病接种新方法[J].植物保护，1994（5）：35-36.

[3] 李永镐，徐丽波.甘蓝黑腐病苗期抗病性鉴定方法的研究[J].东北农学院学报，1990，21（2）：125-129.

[4] 程伯瑛，武永慧，王翠仙，等.惠丰甘蓝对黑腐病的抗性鉴定研究[J].北方园艺，2002（6）：48-49.

[5] 吴国顺.日本对几种蔬菜病害抗病性鉴定方法的研究[J].中國蔬菜，1994（1）：59-60.

[6] 李经略.十字花科蔬菜黑腐病的调查研究[M]//陕西植物保护研究所. 植物保护研究. 西安：陕西科学技术出版社，1992.

[7] 李明远.我国北方大白菜病害现状及发展的浅见[J].中国蔬菜，1993（4）：38-40.

[8] 芦燕.大白菜黑腐病病原菌鉴定和抗病性鉴定方法研究[D].陕西杨凌：西北农林科技大学，2008.

[9] 方智远，李经略.甘蓝抗病育种研究进展[M]//李树德.中国主要蔬菜抗病育种进展.北京：科学出版社，1995：583- 584.

[10] 解永梅，张成玲，赵永强，等.山东省大白菜黑腐病病原的鉴定及其生物学特性的研究[J].山东农业科学，2007（6）：68-70.

[11] 解永梅.山东省十字花科蔬菜黑腐病菌的鉴定及大白菜品种抗病性研究[D].山东泰安：山东农业大学，2008.

[12] 郑学立，谢鑫鑫，林峰，等.福建地区不结球白菜黑腐病病原菌的分离与初步鉴定[J].福建农业学报，2017，32（12）：1335-1340.

[13] 翟文慧，张涛涛，胡俊，等.大白菜黑腐病鉴定的湿度试验及其苗期与成株期抗病性的相关分析[J].中国蔬菜，2010（10）：59-63.

[14] 张玉勋，曲士松，黄宝勇，等.萝卜种质资源抗黑腐病鉴定[J].山东农业科学，2000（6）：33-34.

[15] 黄德芬，李成琼，司军，等.甘蓝抗黑腐病离体鉴定方法的研究[J].西南大学学报（自然科学版），2011，33（8）：5-9.

[16] 曹建琴，王静，顾蓉.甘蓝品种黑腐病抗性试验[J].山西农业科学，2017，45（7）：1153-1156.

[17] 刘莉莉，文正华，单晓政，等.青花菜黑腐病致病菌的分离和鉴定[J].中国瓜菜，2018，31（7）：18-22.

[18] 朱平川，卢洁，张昭颖，等.广西十字花科黑腐病菌致病性分化及遗传多样性分析[J].基因组学与应用生物学，2015，34（3）：541-547.

[19] FARGIER E， MANCEAU C.Pathogenicity assays restrict the species Xanthomonas campestris into three pathovars and reveal nine races within X. campestris pv. campestris[J].Plant Pathology，2007，56 （5）：805-818.

[20] CRUZ J，TENREIRO R，CRUZ L.Assessment of diversity of Xanthomonas campestris pathovars affecting cruciferous plants in Portugal and disclosure of two novel X. campestris pv. campestris races[J].Journal of Plant Pathology，2017，99（2）：403-414.

[21] LIAO C T， LIU Y F， CHIANG Y C， et al.Functional characterization and transcriptome analysis reveal multiple roles for prc in the pathogenicity of the black rot pathogen Xanthomonas campestris pv. campestris[J].Research in Microbiology，2016，167（4）：299-312.

[22] ANDRADE A E，SILVA L P，PEREIRA J L，et al.In vivo proteome analysis of Xanthomonas campestris pv. campestris in the interaction with the host plant Brassica oleracea[J].FEMS Microbiology Letters，2008，281（2）：167-174.

[23] SANTOS C，MAXIMIANO M R，RIBEIRO D G，et al.Differential accumulation of Xanthomonas campestris pv. campestris proteins during the interaction with the host plant：Contributions of an in vivo system[J].Proteomics，2017，17（12）：1700086.

[24] 孟雪嬌，史庆馨，陈立新.大白菜黑腐病研究进展[J].中国瓜菜，2019，32（4）：8-11.

[25] AFRIN K S，RAHIM M A，RUBEL M H，et al.Development of race-specific molecular marker for Xanthomonas campestris pv. campestris race 3，the causal agent of black rot of crucifers[J].Canadian Journal of Plant Science，2018，98（5）：1119-1125.

[26] RUBEL M H， ROBIN A H K， NATARAJAN S， et al.Whole-genome re-alignment facilitates development of specific molecular markers for races 1 and 4 of Xanthomonas campestris pv. campestris，the cause of black rot disease in Brassica oleracea[J].International Journal of Molecular Sciences，2017，18（12）：2523.