辣椒单倍体育种技术研究进展

姚秋菊 常晓轲 程志芳 韩娅楠 张玉乐 王彬 刘卫

摘 要：单倍体育种是当前非常重要的育种技术之一。辣椒单倍体育种技术包括：花药培养技术和小孢子培养技术。单倍体通过自然加倍和人工加倍，为新品种培育、DH群体构建和遗传分析、遗传图谱构建提供了重要的材料。笔者论述了辣椒花药培养和小孢子培养2种单倍体诱导技术的研究进展、存在的问题以及存在的潜在价值，旨在为辣椒育种提供参考，促进辣椒单倍体育种技术的进一步发展和完善。

关键词：辣椒;单倍体;花药培养;小孢子培养;育种

中图分类号：S641.3 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2021）07-001-06

Advances of the haploid induction technology in pepper

YAO Qiuju1， CHANG Xiaoke1， CHENG Zhifang1， HAN Yanan1， ZHANG Yule2， WANG Bin1， LIU Wei1

（1. Horticultural Institute Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450000， Henan， China; 2. Zhengzhou Agricultural Technology Extension Center， Zhengzhou 450000， Henan， China）

Abstract： Haploid breeding is one of the most important techniques. Capsicum haploid breeding technology includes anther culture technology and microspore culture technology. By natural and artificial doubling， haploid is important for breeding， DH group building and genetic analysis， genetic map construction. The paper summarized the research progress， problems and the potential application of the induction technology of anther culture and microspore culture， aiming to provide reference for pepper breeders and promote the further development and improvement of haploid breeding technology in pepper.

Key words： Pepper; Haploid; Anther culture; Microspore culture; Breeding

單倍体育种技术已成为当前植物生物技术领域令人瞩目的技术之一。单倍体植株在转基因中有很重要的作用，转化后的植株不存在显性和隐性问题，能够稳定遗传。单倍体培育成的双单倍体不存在等位基因的显隐性关系，隐性基因可以得到充分的利用。获得单倍体有2种方式：一是自然突变，自然界自然形成的单倍体概率极低，仅有0.002%～0.02%[1];二是人工诱变，包括小孢子培养法和花药离体培养法、未受精子房离体培养法、辐射花粉诱导法、着丝粒介导法等。近年来，小孢子培养、花药培养启动胚胎发育的方法成为各国科学工作者的研究热点。单倍体育种广泛应用于十字花科、玉米、小麦、林木等作物上[2-5]。获得辣椒单倍体的途径主要有辣椒花药培养、辣椒小孢子培养。其中，花药培养技术研究比较深入系统，选育了海花系列[6-7]、海丰系列 [8-9]、塞花一号[10]、豫07-01[11]等一系列优异的品种，并被广泛推广，备受市场欢迎，推动了辣椒市场的发展。笔者总结了辣椒单倍体育种技术在国内外的最新研究进展，从单倍体技术中存在的问题、DH加倍和单倍体在辣椒中的应用方面做了初步归纳分析，以期为研究者们提供一些参考。

1 辣椒单倍体诱导技术

1.1 花药培养技术

辣椒花药培养单倍体育种技术是1973年开始发展起来的一种新型育种方法[12-13]，是指用花药培养技术得到单倍体株系，随后加倍获得双单倍体（Double Haploid，简称DH系），直接获得纯系。辣椒花药培养技术具有缩短育种时间、快速获得纯系和创造变异等特点，成为研究的热点，在理论研究方面获得了很大的进展，同时逐步进入实际应用阶段，配置获得的杂交种很具优势，形成了一个相对完整的辣椒育种技术体系。仍有一些影响因素阻碍了辣椒花药培养技术的发展，比如基因型、植株生长状态、预处理、培养条件、污染率等等，其中，影响最大的是基因型依赖、污染率高等问题，使该技术的发展受到了阻碍，也限制了辣椒花药培养技术的推广应用。

影响辣椒花药培养的第一个重要因素是基因型。Ali等[14-19]研究表明，同样的培养条件，不同辣椒基因型的单倍体诱导率差异很大。外国学者[20]对500个不同基因型辣椒材料进行花药培养，发现其单倍体诱导率介于0～76%之间。李怡裴等[21]研究13个加工型辣椒的花药诱导，其中能够成功诱导出胚状体的基因型占供试材料的92.31%，胚状体的诱导率差异比较大，在0.17%～25.31%之间。王仲慧等[22]诱导13个不同基因型辣椒，8个基因型能够获得健康的再生植株，13个基因型的出胚率差异明显。黄亚杰等[23]发现大果甜椒类型极易出胚。王立浩等[24]对不同基因型优化培养基配方，能够提高胚状体的诱导率。基因型不仅影响辣椒花药培养胚状体的诱导率，而且基因型不同，诱导产生单倍体或二倍体的比例也可能会存在差异;若供体植株是经加倍的单倍体系，则花药培养时雄核诱导率高，但是原始育种材料为异源的情况则难以预测。

大量文献表明，污染率是影响辣椒花药培养成苗的另外一个重要因素。有关报道指出，辣椒花药培养中污染率为50%～100%，是辣椒花药培养能否成功的关键因素之一，因此，辣椒花药培养首先需要解决组织培养中的污染问题。除了人为操作不当，培养材料的彻底灭菌是植物组培工作中的重要环节，它既要求将外植体表面的微生物彻底被杀死，又要求尽可能减少外植体组织和表面细胞受到伤害[25]。梁宝萍等[26]用0.1% HgCl2的消毒效果比5% NaCl的好，0.1% HgCl2灭菌10 min效果最好，花药的存活率最高。张天翔等[27]先用75%酒精消毒1 min，然后用0.1% HgCl2消毒10  min，可以有效降低污染率，提高花药存活率。张晓芬等[28]在甜椒抑菌试验中，用山农一号Ⅲ的效果最好。在许多作物上的研究表明，抗生素可以有效控制作物组织培养过程中发生的细菌性或者真菌性污染。但是很少在辣椒花药培养中应用，抗生素的类别、使用浓度等对外植体的生长发育都会产生不同的影响，使用浓度不合适会显著抑制植物体的正常生长发育，因此需要科技工作者深入研究抗生素在辣椒花药培养中的抑菌作用。杨博智等[29]通过添加抑菌剂进行辣椒开放式花药培养，可以简化培养程序、减少污染源。另一种方法是用镊子轻轻剥去花蕾顶部3/4的花萼，露出青绿色的花瓣时再灭菌，结果表明这样更易杀死花蕾表面细菌和内生菌，花药污染率能降低至5%以下[30]。

1.2 小孢子培养技术

小孢子培养技术是一种在花药培养的基础上发展起来的高效再生技术体系，与属于器官培养的花药培养不同，属于单细胞培养，小孢子的单倍性和单细胞特性为遗传转化提供了便利条件。小孢子培养主要是通过胚胎发生途径发育成植株，没有经过愈伤组织阶段，减少了因孢子体变异而引起的农艺性状退化，与花药培养相比，显著提高单倍体产生频率。因此，国内外都开展了此项研究，并且在甘蓝型油菜、马铃薯、大麦、水稻、玉米、小麦、亚麻等粮食和经济作物以及众多芸薹属蔬菜上获得成功[2-5]。但是辣椒小孢子培养起步较晚，目前技术体系还不健全，培养方法不完善，诱导率不高，小孢子游离后会快速地大量死亡[31-32]，需要解决的问题有很多。亟需解决的问题一个是优化小孢子培养方法，另外一個是提高小孢子诱导率。

韩国研究者Kim等[33]2007年第一次成功地应用了辣椒游离小孢子培养技术，获得了较高的胚状体发生率，最终获得健康的再生株系。李春玲等[34]2008年采用固液结合的方法，先花药预培养，再用液体培养基上振荡培养游离小孢子的方法，成功获得胚状体，并成功移栽再生株系。国内外学者[35-43]成功诱导辣椒小孢子胚状体。Supena等[37]用印度尼西亚辣椒，用看护培养的方法，成功诱导出辣椒再生株系，这是第一次报道成功的案例。成妍等[44]对比了小孢子看护培养、机械游离培养、两者相结合培养3种方法的效果，结果表明看护培养和机械游离相结合的胚胎诱导最好，说明辣椒小孢子最初的脱分化对花药壁有依赖作用，花药壁组织在小孢子培养前期的作用十分重要，不仅能保持适当的渗透压，还能从培养基中获取营养，供小孢子生长发育。刘凡等[45]通过培养辣椒游离小孢子细胞团获得了单倍体及双单倍体植株。目前，主要有3种辣椒小孢子培养方法：第一种是自然游离法。花药在液体培养基中经过一段时间的培养，药室自然开裂，小孢子从花药里散落出来，把花药取出，制成小孢子悬浮液进行培养。第二种是机械游离法。采用挤压法使小孢子游离出来，经过过滤，用液体培养基制成小孢子悬浮液。第三种是先花药培养再机械游离法。将花药接种于固体培养基，在33 ℃下暗培养7 d后，选取无污染无褐化且膨大的花药进行机械游离。目前，研究者使用最多的是自然游离方法，固液双层分离，既减少了机械对小孢子的损伤，也避免了花药培养过程中愈伤组织易褐化的问题。

近几年来，研究者[46-47]尝试不同的方法来提高辣椒胚诱导率，不同预处理、不同生长环境、不同培养温度等都会对诱导率产生影响。王烨等[31]研究了5种预处理（低温、高温、无碳源、秋水仙素和甘露醇）对辣椒小孢子诱导率的影响，结果呈现出不规律态势。小孢子培养中，激素是必不可少的重要成分。且经常使用的有生长素（如2，4-D、IAA、NAA等），以及细胞分裂素（如ZT、6-BA、KT等）。生长素主要用来诱导根分化以及细胞分裂，而细胞分裂素在促使细胞分裂、胚状体形成和愈伤组织生根生芽方面应用较广。Cheng Yan等[48]在研究辣椒小孢子培养时，添加不同量的活性炭和激素来提高小孢子胚的诱导率。添加适量的活性炭能够提高小孢子胚的诱导率，李怡斐等[21]研究发现加入活性炭的加工型辣椒胚状体诱导率最高可达22.92%。因为活性炭能够吸附培养基中、空气中和试验材料中的抑制物质，而且活性碳能吸附和清除小孢子脱分化时产生的有毒物质。越来越多的研究者通过尝试添加不同的诱导剂来提高胚状体的诱导率，如Heidari-Zefreh等[49]用适量的腐胺和抗坏血酸来提高甜椒小孢子培养胚状体的诱导率。因此，随着国内外研究的不断深入、辣椒材料的不断积累和更新，以及培养条件的不断完善，辣椒小孢子培养技术正向着克服技术难关、克服不同限制因素的方向发展。

2 辣椒单倍体加倍技术

花药培养和小孢子培养选育出来的单倍体育种材料，因含有一套染色体，因此单倍体的植株生长一般比较弱小，叶片短而窄小，并且高度不育，不能直接应用于辣椒遗传育种，只有经过加倍，形成正常的双单倍体才能应用在育种和生产中。目前，单倍体加倍的主要方法是自然加倍法和人工加倍法。

2.1 辣椒自然加倍法

花药、小孢子培养得到的单倍体植株都具有自然加倍的现象，作物不同自然加倍率不尽相同，同一作物不同基因型的自然加倍率也不完全相同。辣椒自然加倍率为30%～70%[50];可以看到自然加倍不成功的单倍体株系还有相当大一部分，为了充分利用这部分材料，找到优良的纯系，研究者采用单倍体植株叶片等外植体进行离体培养，使其再次自然加倍，在小麦上已经取得了成功[4]。

2.2 辣椒人工加倍法

自然加倍现象主要发生在花药、小孢子培养过程中，在再生植株生长阶段的自然加倍概率很小，因此，运用人工加倍方法对单倍体进行规模加倍显得尤为重要。人工加倍中主要应用化学试剂诱导方法，目前，加倍试剂应用最多的是秋水仙素，它会阻碍纺锤丝的形成，使减数分裂不能正常发生，使染色体停滞在分裂中期，促使染色体加倍。基于植物细胞具有全能性的原理，利用植物器官或组织作为外植体进行离体培养，采用秋水仙素诱导染色体加倍具有加倍效果好、嵌合率低等优越性。在离体加倍培养中，外植体的类型是影响加倍效果的主要因素之一，在小苗期用秋水仙素处理根尖或者茎尖，可使单倍体基因组二倍化。用秋水仙素加倍率在50%～75%，用0.04%秋水仙素处理1个月苗龄的再生植株6 d，加倍率可高达95%[51]。赖黎丽等[52]用0.25%的秋水仙素处理成株，处理12 h加倍效果最佳。秋水仙素对外植体的作用时间直接影响着再生植株的加倍效果，处理的时间越长，加倍的效果就越显著，同时秋水仙素对外植体的毒害作用也会越严重，比如引起外植体褐化等[53]。

因为秋水仙素毒性大，基因之间重组率比较低，人工诱变畸形率高，研究者尝试了用不同的方法进行辣椒单倍体加倍。已有报道指出甲基胺草磷、氟乐灵和炔苯酰草胺等除草剂对单倍体植株具有良好的加倍作用，同时毒性较低，长时间的磺胺乐灵处理，可能会诱导大量的二倍体化细胞，减少嵌合体植株的出现[54]。

3 单倍体技术的应用

3.1 新品种培育

采用常规育种方法获得纯合品系需要连续4～5年的自交选择，并且不能实现所有性状的绝对的纯合，而双单倍体技术只需1～2代即可获得遗传上100%的纯合品系，而且加倍单倍体的隐性基因不会受显性基因遮盖而能够正常表达，可以显著提高基因型选择效率和选择的准确性，有利于多基因重组和隐性基因的选择。辣椒单倍体技术能够分离获得一些具有特殊性状的育种材料，并通过加倍处理快速获取纯合的育种材料，是一种快速、经济、有效的育种手段。自1973年王玉英等[12]和George等[13]报道获得辣椒单倍体植株开始，随着单倍体技术和染色体加倍方法的不断完善，国内外研究者陆续培育成功一批辣椒品种。北京市海淀区組培技术实验室1979年获得辣椒单倍体幼苗，自此开始了单倍体在辣椒育种中的研究应用，相继培育出了海花系列、海丰系列[6]品种。匈牙利对辣椒单倍体的研究比较深入，相继获得了Sláger、Délibáb、Bolero等品种[55-57]。用花药或者小孢子培养出的双单倍体作为双亲或者是亲本之一的杂交种，更加稳定和纯合[58]。

3.2 DH群体构建和遗传分析

DH群体与分子标记辅助选择（molecular assisted selection， MAS）相结合定向选择目标植株，减少了田间工作和世代年数。李怡斐等[21]通过花药培养与MAS相结合，培育了抗疫病加工型辣椒品种，快速创制特异育种新种质，加速了育种进程。张树根等[59]研究103个双单倍体（DH）系的DH群体的果实性状的遗传规律，其群体由花药培养技术得来。因为此群体的每一个品系都是完全同质纯合的，所含信息量小，无遗传变异，遗传信息可以继代保留，是数量性状位点分析的良好群体。于进步[60]利用8个辣椒DH系分析主要性状的配合力和遗传力，显示了更强的说服力。

3.3 遗传图谱构建

辣椒双单倍体群体是完全纯合的，遗传性质稳定，遗传背景一致，是遗传作图的理想材料。利用遗传图谱对控制目标性状的基因进行定位、连锁分析以及克隆是开展分子标记辅助选择育种、验证基因功能及其作用机制的基础。Lefebvre等[61]用来自于种内杂种F1代的3个DH群体，用RAPD和RFLP标记技术，构建了一张14个连锁群的遗传图谱。从1995年法国研究者Lefebvre等[62]构建并使用DH的第一张遗传图谱开始，至2016年已有12张使用DH群体构建的图谱，占辣椒遗传图谱总数的22%。DH群体遗传作图已成功应用于多种重要作物，例如小麦、油菜、大麦和水稻等[63]。DH群体已被广泛用于QTL作图，例如大麦抗赤霉病，水稻砷富集、产量相关性状、株高和蒸煮品质，以及小麦株高、抽穗期、面粉颜色、磷利用效率、缺锌和抗黑穗病等QTL的研究[64]。尤其在水稻育种中，DH系群体已用于产量、品质等农艺性状的QTL定位。

4 展 望

近年来，辣椒单倍体育种技术研究有了一定的进展，但仍然不能完全满足辣椒育种工作者的需求。辣椒单倍体培养技术中存在的基因型依赖性强、污染严重、培养方法不够优化、胚状体诱导率低等问题，导致该技术应用不是十分广泛和深入。

目前，辣椒单倍体育种技术还不够完善，科学工作者应当深入研究胚状体的调控机制，以最终达到人为调控单倍体培养的目的，可以与遗传学方法、分子生物学方法等有机结合。小孢子胚胎发生是由多种信号通路所介导的，并且这些信号通路之间存在着交叉互作，或者是不同的胁迫信号导致了相同的下游反应。因此，相关研究应整合基因组学、蛋白质组学和代谢组学，从系统生物学角度揭示不同信号级联的相互关系，才能最终弄清小孢子胚胎发生的机制。目前掌握了一些有关小孢子胚胎诱导和胚胎形成的细胞学及分子学信息[65-66]，但从配子体到胚胎形成途径的机制仍不明确，仍需深入研究花粉发育过程，研究小孢子发育机制，以实现对小孢子发育的主动调控。

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