脂质特异基质分散萃取超高效液相色谱–串联质谱法测定肉制品中4种兽药残留

胡雪郢，薛丰

（重庆市渝中区疾病预防控制中心，重庆 400010）

β-受体激动剂（俗称为瘦肉精），曾被用作牛、羊等畜禽的饲料添加剂，其能够促进动物体蛋白质沉积、加快脂肪分解，显著提高脂肪性动物的高饲料转化率（廋肉率）［1］，但是科学知识缺乏和经济利益驱使，导致不规范、不合理使用瘦肉精的现象普遍存在。药物滥用会导致药物在动物体内滞留和蓄积，并以残留的方式进入人体以及生态坏境中。误食含瘦肉精的肉类后，会出现头晕、恶心、手脚颤抖、心跳加速甚至心脏骤停，甚致昏迷死亡，对心律失常、高血压、青光眼、糖尿病和甲状腺机能亢进等患者有极大危害［2］。随着全球经济一体化和食品贸易国际化，食品安全已经成为一个世界性的公共卫生问题，而动物源食品违禁药物残留成为全世界关注的焦点［3–4］。为确保食品安全，我国农业部发布的193号公告中明确规定了动物性食品中不得检出β-受体激动剂类药物。

目前，β-受体激动剂残留的检测方法主要有发光法［5–7］，气相色谱法［8–10］和质谱法［11–22］。发光法属于快检方法，其操作简单，成本低，但特异性差，灵敏度较低，目前只作为应急快检手段和初筛方法；气相色谱法测定需要进行样品衍生化处理，操作烦琐、结果重现性、可靠性较差，且灵敏度较低，仅能依靠保留时间来进行定性和定量分析等；质谱法通过测定质核比对物质进行定量分析，其特异性和灵敏度较好，气相色谱–质谱法［11–12］应用于瘦肉精残留的测定，与单纯气相色谱法相比，其特异性有所提高，但仍需要对样品进行衍生化反应。液相色谱–质谱法（LC–MS／MS）［13–21］因其灵敏度高、分离性好且操作简便、无需衍生化反应等优势，成为兽药残留检测的首选方法。

肉类食品中兽药残留的检测主要面临两方面的挑战：（1）兽药原型进入动物体内会发生代谢反应，生成一系列的代谢产物，导致原药检测结果的假阴性；（2）动物组织以及内脏中含有大量的蛋白质和脂质，它们性质、含量各异，尤其是大量饱和与非饱和脂肪酸的存在，使得样品基质效应增强；即便通过内标标准曲线［13，21］或者基质曲线来减轻基质效应，也会对测定结果的准确性和重现性产生较大影响，甚至导致方法检出限无法达到限量值要求。

因此，建立高效、快捷的肉类样品中复杂脂质去除前处理方法，是肉类样品检测函待解决的问题。目前，肉类食品中瘦肉精残留检测的前处理方法主要包括：固相萃取（SPE）法［9–10，14–18］和传统基质分散固相萃取（QuEChERS）［19–21］法，后者操作简单、快捷，通用性强，已应用于蔬菜、水果、水产品等样品中农残和兽残的测定，但是对于肉类基质而言，其脂类净化能力有限，不仅无法有效降低基质效应，且在大量样本分析过程中，脂质还会导致色谱和质谱系统发生污染和堵塞，因此，使用新型脂质特异性吸附材料（如免疫亲和萃取法），成为解决此类问题有效途径之一。已有文献报道，将脂质特异性吸附材料用于水产品、烘焙食品中抗生素［22］、抗氧化剂［23］、真菌毒素［24］以及牛肉中多种氨基甲酸酯类农药残留的检测［25］，尚未发现在高脂肪含量的猪肉和猪肝样品中β-受体激动剂残留的检测的相关报道。笔者采用脂质特异性吸附EMR–Lipid QuEChER法，结合超高效液相色谱–串联质谱法（UPLC–MS／MS），建立肉类食品中4类β-受体激动剂残留的检查方法，并与已有混合阳离子交换（MCX）固相萃取法进行对比，结果证明，脂质特异性EMR–Lipid QuEChER方法能够更为有效的去除肉类样品中的脂质成分，降低基质效应，重复性好，能够满足日常检测工作需求。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱–串联质谱仪：Dionex UltiMate 3000／AB Sciex 3200 Qtrap型，美国应用生物系统公司。

全自动固相萃取仪：GX–274型，美国吉尔森公司。

恒温震荡培养箱：ZWY–100H型，上海智城分析仪器制造有限公司。

高速冷冻离心机：AvantiJ–26XP型，美国贝克曼库尔特公司。

电子天平：BL310型，感量值为0.01 g，德国赛多利斯公司。

电子天平：XSR204／AC型，感量值为0.1 mg，梅特勒–托利多国际有限公司。

氮吹仪：N–EVAP型，美国Organomation公司。

涡旋混匀仪：VORTEX 3型，艾卡(广州)仪器设备有限公司。

增强型脂质去除分散SPE管：Bond Elut EMR–Lipid型，美国安捷伦科技公司。

β-葡萄糖醛酸苷肽酶／芳基磺酸脂酶：纯度为99%，德国默克公司。

尼龙滤膜：0.22 μm，德国默克公司。

甲醇、甲酸：质谱纯，美国赛默飞世尔科技有限公司。

乙酸–乙酸钠缓冲溶液：优级纯，0.2 mol／L，pH 5.2，美国希格玛公司。

氨水：优级纯，美国赛默飞世尔科技有限公司。

实验用水为超纯水，电阻率大于18 MΩ·cm，由Mili–Q超纯水系统纯化制得。

4种β-受体激动剂标准品以及对应同位素内标标准品基本信息见表1。

表1 4种β-受体激动剂标准品以及对应同位素内标标准品

1.2 溶液配制

一级混合标准溶液：分别取4种β-受体激动剂标准品各100 μL于10 mL容量瓶中，用50%甲醇溶液稀释定容，得到一级混合标准溶液，4种β-受体激动剂的质量浓度均为1.0 μg／mL。

二级混合标准溶液：准确吸取一级混合标准溶液100 μL，用50%甲醇稀释至1 mL，得到二级混合标准溶液，4种β-受体激动剂的质量浓度均为100 ng／mL。

内标储备液：分别用1 mL 50%甲醇溶解1.00 mg D6-莱克多巴胺、1.00 mg D3-沙丁胺醇和1.00 mg D9-特布他林，得到质量浓度均为1.00 mg／mL的D6-莱克多巴胺、D3-沙丁胺醇、D9-特布他林的内标储备液。用2.13 mL 50%甲醇溶解2.40 mg D9-盐酸克伦特罗，配制成质量浓度为1.00 mg／mL的D9-盐酸克伦特罗内标储备液。其中，D9-盐酸克伦特罗的质量浓度以D9-克伦特罗计，换算系数为88.8%。

混合内标应用液：分别取4种同位素内标储备液各10 μL于10 mL容量瓶中，用50%甲醇溶液稀释定容，得到4种同位素内标混合应用液，质量浓度为1.0 μg／mL。

内标系列标准工作溶液：分别准确吸取二级混合标准溶液5、10、20、50 μL，以及一级混合标准溶液10、30、50 μL，分别加入30 μL内标混合应用液，再用超纯水稀释至1 mL，混匀。4种化合物标准系列溶液浓度依次为：0.5、1.0、2.0、5.0、10、30、50 ng／mL；4种内标化合物的浓度均为30.0 ng／mL。

1.3 仪器工作条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Welch Xtimate C18型柱［100 mm×2.1 mm，3 μm，月旭科技（上海）股份有限公司］；柱温：40 ℃；流量：300 μL／min；进样体积：10 μL；流动相：A相为0.1%甲酸，B相为甲醇，梯度洗脱程序列于表2。

表2 梯度洗脱程序

1.3.2 质谱条件

电离方式：ESI+；喷雾电压：5 000 V；离子源温度：500 ℃；雾化气(Gas l)流量：50 mL／min；辅助加热气(Gas 2)流量：50 mL／min；气帘气流量：25 mL／min；碰撞气流量：6 mL／min；监测模式：多反应监测模式(MRM)。

1.4 样品前处理

1.4.1 样品提取

称取5 g（精确到0.01 g）粉粹的样品于50 mL离心管中，加入30 μL 1.0μg／mL的混合内标应用液，再加入15 mL 0.2 mol／L pH 5.2乙酸–乙酸钠缓冲溶液，均质器匀浆后，再加入100 μLβ-葡萄糖醛酸苷肽酶／芳基磺酸脂酶，于（37±1）℃震荡酶解过夜，然后于4 ℃以12 000 r／min离心10 min，取上清液待净化。

1.4.2 样品净化

（1）混合型强阳离子交换反相吸附（MCX）固相萃取法。取Oasis MCX型固相萃取小柱［(150 mg)／3 mL，美国沃特世公司］，经40 mmol／L HCl水溶液活化后，取上清液全部上样，分别用5 mL水和甲醇淋洗，再用6 mL 5%氨水–甲醇分3次洗脱，每次2 mL。合并洗脱液，经氮气吹干后，用甲醇–0.1%甲酸（5∶95）定容至1.0 mL，用0.22 μm滤膜过滤，采用UPLC–MS／MS法测定。

（2）增强型脂质去除(EMR–Lipid QuEChERS)法。移取上清液至EMR–Lipid d-SPE管中，然后加入等体积的甲醇，立即涡旋混合使样品分散，涡旋60 s后以5 000 r／min离心3 min，移取5 mL上清液至含有2 g 盐(氯化钠与硫酸镁质量比为1∶4)的15 mL EMR–Lipid Polish管中，漩涡混合1 min后，以5 000 r／min离心3 min ，上清液经氮气吹干后，用甲醇–0.1%甲酸（5∶95）定容至1.0 mL，用0.22 μm滤膜过滤，采用UPLC–MS／MS法测定。4种β-受体激动剂标准色谱图见图1，其同位素内标标准色谱图见图2。

图1 4种β-受体激动剂标准色谱图

图2 4种β-受体激动剂同位素内标标准色谱图

2 结果与讨论

2.1 4种β-受体激动剂动物体内的存在形式研究

药物进入动物体内，会经过一系列的酶促反应之后排出体外，反应中将生成一系列的代谢产物，由于药物理化性质的差异以及作用位点不同，其代谢场所各异，其中参与药物代谢比较活跃的组织器官包括肠道、肝脏、肾脏以及肌肉组织。本研究通过体外培养模拟肝脏和肌肉组织中4种β-受体激动剂的代谢反应，研究4种化合物在上述动物组织中的存在形式。

称取5.0 g新鲜猪肉和猪肝各两份，设置实验组和对照组，每组含猪肉和猪肝样品各1份；均加入1 mL 50 ng／mL的内标标准曲线系列溶液，37 ℃恒温培养24 h，实验组培养过程中不加入β-葡萄糖醛酸苷肽酶／芳基磺酸脂酶，对照组则完全按照1.4.1标准流程进行操作，培养完成后所有样品按照1.4.2（1）方法进行样品净化后测定。结果表明，4种化合物在猪的肌肉和肝脏中几乎都以化合物原型存在。

2.2 离子对选择和质谱参数优化

将一级混合标准溶液和混合内标应用液等体积混合，通过针泵直接进样方式，对每种化合物的母离子和子离子进行选择，同时分别优化其质谱采集参数：碰撞电压（CE）、去簇电压（DP）、入口电压（EP）和碰撞池出口电压（CXP），优化结果列于表3。

表3 4种β-受体激动剂及其对应内标物质监测离子、质谱参数

2.3 前处理方法比较

动物组织样品进行分析时，大量脂质的存在是干扰分析结果准确性的主要原因。动物所含脂质的分子量较大（含碳原子数≥6），且多为直链结构，支链较少，EMR–Lipid QuEChERS中的脂质特异性吸附填料通过其自身特殊的多孔构象，能够对长直链脂肪进行基于空间位阻理论的特异性吸附。本研究以1.4.2中混合型强阳离子交换反相吸附（MCX）固相萃取法为参照，与EMR–Lipid QuEChERS法进行比较，通过相同基质（肌肉组织和肝脏）提取液进行净化处理，对样液进行一级质谱（MS1）100～850m／z质量范围内全扫描分析。结果表明，选择C18填料的色谱柱、0.1%甲酸水溶液和甲醇作为流动相的色谱分离体系中，脂质的保留能力较强，其色谱流出时间位于流动相中有机相比例较高的时间段（5～7 min），在此时间段内，经MCX处理的样液中有明显杂质色谱峰出现。与MCX法相比，EMR–Lipid QuEChERS法对猪肉以及猪肝中脂质去除效果更好。

2.4 线性方程与检出限

为了尽量减少基质效应的影响，采用内标标准曲线法进行定量，以4种β-受体激动剂类药物的色谱峰面积（x）为横坐标，质量浓度（y）为纵坐标绘制标准曲线，依据信噪比S／N=3计算方法的检出限。各化合物线性回归方程、相关系数、检出限列于表4。结果表明，4种化合物的质量浓度在0.5～50 ng／mL范围内线性关系良好，相关系数均大于0.997，检出限均为0.1 μg／kg。

表4 4种β-受体激动剂类药物的线性方程、相关系数、检出限

2.5 精密度与加标回收试验

取经过检测的空白新鲜猪肉和猪肝样品，选取2.0、5.0、10.0 ng／kg 3个加标水平，每个浓度水平平行测定6次，按照1.4.2（2）中优化的实验方法进行分析，计算目标化合物的回收率和相对标准偏差（RSD），结果列于表5和表6。由表5和表6可知，4种β-受体激动剂在猪肉基质中的加标回收率为79.8%～92.3%，测定结果的相对标准偏差为2.95%～9.50%；在猪肝中的加标回收率为81.5%～95.6%，测定结果的相对标准偏差为2.47%～8.05%。表明该方法具有较高的准确度和精密度，满足日常检测需求。

表5 4种β-受体激动剂类在猪肉样品中加标回收试验结果

表6 4种β-受体激动剂类在猪肝样品中加标回收试验结果

2.6 实际样品测定

将本研究所建立的脂质特异性基质分散（EMR–Lipid QuEChERS）净化结合超高效液相色谱–串联质谱法对市售的34个肉类样品（包括猪肉、猪肝、鸡肉、牛肉、鱼肉5个大类）进行测定，发现未检出克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林的违法添加。

3 结语

脂质特异性基质分散（EMR–Lipid QuEChERS）净化法用于肉类样本中脂质的去处，采用类似QuEChERS标准样品前处理流程，相比传统固相萃取法，操作更加简便、灵活和快捷，且脂质去处效果也更好，结合超高效液相色谱–串联质谱法的高特异性和灵敏度，能够满足日常工作中兽药残留的检测工作。由于EMR–Lipid QuEChERS能够特异性得吸附脂质（尤其是含6个C以上的长链脂肪），而非对待测物进行吸附和富集，因此，此法也可应用于其他高油脂样品中脂质的去除，从而降低机制效应的干扰，提高目标化合的检出限以及定量准确性。