健脾益气方对慢性萎缩性胃炎脾虚证大鼠胃组织的影响

徐雨璇 严展鹏 徐婷婷 王 培 郑 雪 朱方石,

1.南京中医药大学第三临床医学院，江苏南京 210028；2.江苏省中医药研究院中西医结合临床研究室，江苏南京 210028

慢性萎缩性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）指胃黏膜上皮反复受损致腺体萎缩、减少的疾病。CAG 与胃癌发病相关[1]。Notch 信号通路可以促进胃黏膜上皮细胞增殖[2-4]。细胞增殖凋亡失衡是CAG 机制之一[5]。健脾益气方对CAG的临床疗效肯定[6-7]，能保护CAG 大鼠胃黏膜、抑制胃组织Wnt/β-catenin 及PI3K-Akt 信号通路蛋白的表达[8-10]。本研究拟通过健脾益气方干预CAG 脾虚证大鼠，观察其Ki67 及Notch 等信号通路相关蛋白表达，揭示健脾益气方的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 MNNG（日本东京化成工业）；苏木精染液（719054，珠海贝索）；伊红染液（719062，珠海贝索）；大鼠促胃液素（EG038-18，依科赛）和生长抑素（somatostatin，SST）酶联免疫吸附试剂盒（EG027-36，依科赛）；Notch1（AI10126996，Bioss），Notch2（AG09066100，Bioss），Hes1（11988S，CST）。抗体浓度均为1∶1000。

1.1.2 药物 雷尼替丁（150 mg/粒，上海衡山药业，生产批号：200804）；替普瑞酮[50 mg/片，卫材（中国）药业有限公司，1606031]；叶酸片（5 mg/片，天津力生制药股份有限公司，生产批号：1612054）。健脾益气方水提液：茯苓10 g，党参15 g，炒白术10 g，炙甘草3 g，法半夏6 g，陈皮6 g，木香10 g，砂仁6 g，莪术10 g，郁金10 g，云母石30 g，白花蛇舌草30 g（江苏省中西医结合医院药剂科）。

1.1.3 动物 健康SD 大鼠65 只，体重（230±10）g，雄性（动物质量合格证号：SCXK2019-0001，生产许可证号：AEWC-20181205-65，南京药科大学实验动物中心）。

1.1.4 仪器 CT-9 生物组织摊烤片机、CB-08 石蜡包埋机，湖北定源医用材料。RM2245 石蜡切片机，德国Leica。CKX31 倒置生物显微镜，日本Olympus。KHB ST-360酶标仪，瑞士Tecan。

1.2 研究方法

1.2.1 CAG 脾虚证大鼠模型建立及分组干预 选取55 只健康SD 大鼠自由饮食含170 μg/ml MNNG的纯净水及含0.03%雷尼替丁的大鼠饲料制造CAG 大鼠模型，造模24 周。24 周后选取5 只大鼠处死观察其胃黏膜萎缩状态，形成CAG 脾虚证模型[11]。剩余50 只按随机数字表法分为健脾益气方低[13.1 g/（kg·d）]、中[26.2 g/（kg·d）]、高剂量组[52.4 g/（kg·d）]，以及模型组（等量生理盐水）、阳性药组[叶酸2.7 mg/（kg·d）+替普瑞酮13.5 mg/（kg·d）]，每 组 各10 只，另 取10 只健康SD 大鼠作为空白组（等量生理盐水）。六组均灌胃干预8 周，记录其状态和体重。

1.2.2 标本的采集 8 周后，每组取5 只进行标本采集。采用10%水合氯醛进行麻醉（0.3 ml/100 g），腹主动脉取血3～6 ml，静置2 h 后离心5 min（3000 r/min，离心半径为13.5 cm），取上层血清，-80°C 储存。取胃底、胃窦、胃体组织各1 块，甲醛固定。

1.2.3 HE 染色 切片依次浸入二甲苯、梯度乙醇、蒸馏水后苏木精染色3 min，清洗，分化5 s，清洗，梯度乙醇脱水，伊红染色15 s，95%、100%乙醇各5 min，二甲苯5 min，封片。

1.2.4 酶联免疫吸附试验 标准孔10 孔梯度稀释，样本孔中加入待测血清40 μl 及促胃液素、SST 一抗10 μl，封膜。震荡后37℃孵育1 h。洗板30 s 共3 次。加链霉素-辣根过氧化物酶50 μl，封膜，37℃孵育1 h。37℃避光显色15 min。每孔加入50 μl 终止液。酶标仪检测450 nm 波长处吸光度，绘制标准曲线。

1.2.5 免疫组织化学染色 将切片放入二甲苯中5 min共2 次脱蜡，梯度乙醇脱水，蒸馏水清洗；抗原修复液中沸腾持续10 min；清洗，双氧水10 min，封闭1 h；一抗4℃过夜；磷酸盐吐温缓冲液清洗，二抗室温1 h，磷酸盐吐温缓冲液清洗，DAB 显色；苏木精复染30 s，清洗，分化，返蓝，清洗。浸入梯度乙醇、二甲苯，封片。Ki67、蛋白表达量采用Image-ProPlus 6.0 计算其光密度值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 18.0 对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，多组计量资料比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 六组一般情况及体重比较

空白组毛色白有光泽，活动积极。模型组毛色黄易脱落，活动量减少。阳性药组及健脾益气方低、中、高剂量组毛光亮，活动量高。模型组体重低于空白组，健脾益气方中、高剂量组体重高于模型组，差异均有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01）。见表1。

表1 六组体重比较（g，）

表1 六组体重比较（g，）

注：与空白组比较，aaP ＜0.01；与模型组比较，bP ＜0.05

2.2 六组胃黏膜HE 染色情况

空白组胃黏膜上皮层次清楚，腺体正常。模型组胃黏膜上皮变薄，腺体减少，排列疏松、杂乱，可见杯状细胞。其余四组胃黏膜上皮增厚，腺体增加，排列趋向整齐，炎症细胞浸润减少，健脾益气方中剂量组最近似空白组。见图1。

图1 六组胃黏膜HE 染色情况（100×）

2.3 六组血清促胃液素、SST 水平比较

模型组血清促胃液素、SST 水平均低于空白组，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。健脾益气方高剂量组血清促胃液素水平高于模型组，健脾益气方低、中、高剂量组SST 水平均高于模型组，差异均有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01）。见表2。

表2 六组血清促胃液素、SST 水平比较（pg/ml，）

表2 六组血清促胃液素、SST 水平比较（pg/ml，）

注：与空白组比较，aaP ＜0.01；与模型组比较，bP ＜0.05，bbP ＜0.01。SST：生长抑素

2.4 六组胃组织Ki67 蛋白表达情况

模型组Ki67 表达呈浅棕色，其余五组均呈黄棕色，见图2（封三）。模型组Ki67 蛋白表达量低于空白组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。健脾益气方低剂量组Ki67 蛋白表达量高于模型组，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。见表3。

表3 六组胃组织Ki67 蛋白表达量比较（）

表3 六组胃组织Ki67 蛋白表达量比较（）

注：与空白组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bbP ＜0.01

图2 六组胃组织Ki67 蛋白表达情况（免疫组织化学，100×）

2.5 六组胃组织Notch1、Notch2、Hes1 蛋白表达情况

模型组Notch1、Notch2、Hes1 蛋白呈浅褐色，其余五组呈深褐色，见图3～5（封三、封四）。模型组Notch1、Notch2、Hes1 蛋白表达量均低于空白组，差异均有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01）。健脾益气方低、中、高剂量组Notch1、Notch2 蛋白表达量均高于模型组，健脾益气方高剂量组Hes1 蛋白表达量高于模型组，差异竣工有统计学意义（均P ＜0.05 或P ＜0.01）。见表4。

表4 六组胃组织Notch1、Notch2、Hes1 蛋白表达量比较（）

表4 六组胃组织Notch1、Notch2、Hes1 蛋白表达量比较（）

注：与空白组比较，aP ＜0.05，aaP ＜0.01；与模型组比较，bP ＜0.05，bbP ＜0.01

图3 六组胃组织Notch1 蛋白表达情况（免疫组织化学，100×）

图4 六组胃组织Notch2 蛋白表达情况（免疫组织化学，100×）

3 讨论

CAG 属中医“胃痞”“嘈杂”等范畴[12]，脾胃虚弱是主要病机，健脾益气为主要治法[13]。胃黏膜损伤是脾虚的主要原因，脾虚的状态为胃黏膜损伤提供了客观条件，这一恶性循环加重了脾虚的病理改变[14]，“从脾虚论治”CAG的治则观具有理论基础和实践依据。

健脾益气方由党参、炒白术、茯苓、炙甘草、陈皮、法半夏、木香、砂仁、莪术、白花蛇舌草、云母石、郁金组成。党参性平，与炒白术、茯苓、炙甘草合用益气健脾；半夏、陈皮、砂仁、木香理气化痰；莪术、郁金活血消积、行气止痛；云母去瘀生新[15]；白花蛇舌草抗癌变[16]。诸药合用，共奏健脾益气，活血行气之功[13]。

本研究结果显示，健脾益气方低、中、高剂量组一般状态、体重较模型组均改善，以中、高剂量组优势显著。促胃液素由G 细胞分泌，对胃肠道黏膜具有营养作用[17]；SST 由D 细胞分泌，可以减轻细胞脂质过氧化，是胃黏膜防御机制之一[18]。在萎缩和肠化阶段，促胃液素与SST 分泌呈下降趋势[19-21]。健脾益气方高剂量组促胃液素高于模型组，健脾益气方三组SST 均高于模型组，提示其可以修复CAG 大鼠胃黏膜损伤。

胃黏膜细胞增殖是导致CAG 病理改变的核心因素之一，在CAG 发展进程中胃黏膜细胞增殖会出现被抑制的状态[22-23]。Ki67 可评估细胞增殖水平。本研究显示，模型组Ki67 表达下降，用药干预促进了Ki67的表达，以健脾益气方低剂量组为优，提示健脾益气方能改善CAG 胃黏膜上皮细胞增殖阻滞，促进胃黏膜正常细胞的增殖，有利于萎缩的胃黏膜腺体修复。

Notch 信号通路是控制细胞增殖、分化和凋亡的核心途径[24]，由受体（Notch）和配体（Jagged、DLL）及靶基因Hes1 等组成[25-26]。Notch1、Notch2 能促进胃黏膜细胞增殖[2-4]，而胃黏膜细胞增殖被抑制与CAG的发生发展相关[22-23]。据此推测，Notch 信号通路蛋白表达下降导致的细胞增殖阻滞是胃黏膜萎缩和肠上皮化生的机制之一。本研究示，健脾益气方可以促进Notch1、Notch2 及Hes1的表达，以促进胃黏膜上皮细胞增殖，从而改善胃黏膜萎缩的病理改变。但中药不同剂量组间尚未显示出明显差异。本研究为解释健脾益气方对CAG 疗效的作用机制提供了一定的科学依据，至于健脾益气方在Notch 等信号通路中发生分子调节作用的具体过程，有待进一步深入研究。