肿节风炭疽病菌拮抗放线菌的筛选与鉴定

宋利沙，蒋 妮，张占江，蓝祖栽，白隆华

(广西壮族自治区药用植物园，广西 南宁 530023)

【研究意义】肿节风(Sarcandraglabra)为金粟兰科草珊瑚属多年生草本植物草珊瑚[S.glabra(Thunb.)]的干燥全草，具有活血消斑、清热凉血、祛风通络等功效，是中国药典的收录品种[1-2]，也是广西传统瑶药“七十二风”中的重要风药品种之一[3]。近年来，肿节风在广西融安、靖西、东兰等县市大面积种植，从苗期到成株期均出现由半知菌类刺盘孢属黑线炭疽菌(Colletotrichumdematium)引起的叶部病害，平均发生率在50%以上，尤其在融安的林下套种模式下发病率达65%[4]。目前，肿节风炭疽病的防治以化学药剂为主，但长期使用化学药剂容易产生病原菌抗(耐)药、病害易复发及农药残留等负面问题[5]。世界上50%的生物活性化合物由放线菌产生，尤其是链霉菌产生的多抗霉素、井岗霉素和阿维菌素等抗生素已成为实际利用的次级代谢产物[6-8]，并已在农业生产中广泛应用，但至今利用放线菌防治肿节风炭疽病的研究尚属空白。因此，筛选拮抗肿节风炭疽病病原菌的放线菌，对肿节风炭疽病的生物防治具有重要意义。【前人研究进展】链霉菌存在于不同类型的土壤和水中，资源丰富，能产生多种抗菌活性的抗生素，已在生物防治上广泛应用[9-10]。牛红杰等[11]研究显示，从黄瓜根际土壤分离得到的小链霉菌对黄瓜枯萎病病菌(尖孢镰刀菌、茄腐镰刀菌和立枯丝核菌)具有一定的抑制作用。刘琴等[12]研究表明，彻氏链霉菌100倍液灌根对番茄枯萎病的防治效果最佳，达72.84%。涂璇等[13]、申哲等[14]研究发现，淡紫灰链霉菌对番茄早疫病菌和灰霉病菌、柑桔炭疽病菌、黄瓜炭疽病菌、玉米弯孢病菌、小麦赤霉病菌、棉花枯萎病菌、辣椒疫病菌、小麦纹枯病菌、棉花立枯病菌、油菜菌核病菌及苹果树腐烂病菌等多种植物病原菌均有很强的拮抗作用，具有潜在生防价值。Dame等[15]研究发现，从海洋放线菌中分离获得的4种抗生素(寡霉素a和b、巴马霉素和棘孢链菌素)可抑制葡萄霜霉病病菌(Plasmoparaviticola)孢子游动，使其细胞壁溶解，达到防治葡萄霜霉病的目的。Sellem等[16]研究认为，链霉菌发酵提取物可使腐霉菌(Pythiumultimo)菌丝生长受到抑制及卵孢子畸形扭曲。Phuakjaiphaeo等[17]研究表明，从积雪草(Centellaasiatica)根节分离得到1株内生链霉菌，其代谢产生的化合物可导致甘蓝黑斑病菌(Alternariabrassicicola)分生孢子畸形、附着胞不能形成及孢子萌发延迟。Shrivastava等[18]研究显示，印度恒河平原土壤中分离得到的嗜盐放线菌(K20)产生的几丁质酶可溶解菜豆壳球孢菌(Macrophominaphaseolina)的菌丝细胞壁，从而发挥明显的拮抗作用。【本研究切入点】利用生防菌防治植物病害已成为植物病害防治的重要方法之一及国内外研究热点，也是未来绿色中药材发展的趋势，但目前关于筛选拮抗肿节风炭疽病病原菌放线菌的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】从健康肿节风植株根系土壤中筛选拮抗肿节风炭疽病病原菌的放线菌菌株，分析确定其分类地位，采用离体叶片刺伤接种法测定所筛选获得拮抗菌株对肿节风炭疽病的防效，以期为肿节风炭疽病的生物防治提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

肿节风炭疽病菌(编号Z1)由广西壮族自治区药用植物园实验室分离、鉴定和保存；土壤样品采自广西靖西市五岭林场肿节风健康植株根系土壤。

1.2 试验方法

1.2.1 无菌发酵液制备 肿节风健康植株根系土壤取样时采取五点取样法将整株肿节风挖起，用无菌小毛刷刷取植株根系上的土壤，每5株的根系土壤均匀混合为一个样品(200 g)，重复3次，共计15株，编号后封存于保鲜袋中带回实验室，48 h内采用稀释涂布平板法在高氏一号培养基上进行放线菌分离，并通过平板对峙试验，计算分离得到的放线菌对肿节风炭疽病菌的抑制率，筛选对黑线炭疽病具有拮抗活性的放线菌[19-22]。将抑制率最高的拮抗菌株用于下一步抑菌谱试验。挑取抑制率最高的拮抗菌株(JT-2F菌株)单菌落接种于不加琼脂的高氏一号培养基中，28 ℃、180 r/min恒温振荡3 d，得到拮抗菌株的发酵液，用无菌纱布和滤纸过滤后，10 000 r/min离心15 min，取上清液，经0.22 μm滤膜过滤，得到拮抗菌株的无菌发酵液。

1.2.2 JT-2F菌株抑菌谱测定 供试药用植物病害病原真菌三七灰霉病菌(Botrytiscinerea)、三七根腐病菌(Fusariumsolani)、三七黑斑病菌(Alternariapanax)、三七炭疽病菌(Colltetorrichumgloeosporioides)、罗汉果斑枯病菌(Stagonosporopsiscucurbitacearum)、苦玄参叶斑病菌(Alternariaputuminum)、广西莪术叶斑病菌(Phomopsissp.)、豆蔻叶斑病菌(Phyllostictasp.)和艾纳香褐斑病菌(Phomasp.)均由广西壮族自治区药用植物园实验室分离、鉴定、保存；农作物病害病原菌西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、香蕉炭疽病菌(Colltetorrichumgloeosporioides)、香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、香蕉叶斑病菌(Alternariasp.)和烟草灰霉病菌(Botrytiscinerea)均由广西大学植病研究室袁高庆教授提供。

选取1.2.1中对肿节风炭疽病菌防效较佳的放线菌JT-2F和DT-3F菌株，参照程丽娟等[20]、朱宏建等[21]、张瑾等[22]的平板对峙法对上述14种植物病原菌进行抑菌谱测定。将直径为0.5 cm的病原菌组织块置于PDA平板中心，在其两侧等距离处分别接种JT-2F和DT-3F菌株组织块，以单独接种病原菌为对照，每处理3个重复。待对照长满整个平皿时，测量菌落直径并计算抑制率。抑制率(%)=(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100。

1.2.3 JT-2F菌株离体防治试验 参考刺伤接种法进行放线菌对炭疽病菌离体防效试验[23]。选取大小一致的肿节风叶片，先用自来水冲洗干净，75%酒精表面消毒，无菌水冲洗、晾干后置于超净工作台，再用无菌接种针在叶片上刺伤一个直径为6.0 mm的圆形接种面，然后分别在伤口处涂抹(200 μL)稀释10、20、50、100和200倍JT-2F菌株的无菌发酵液及原液，最后在伤口处接种直径7.0 mm的肿节风炭疽病菌菌饼，以涂抹无菌水为对照，重复3次。接种5 d后参考薛应钰等[24]的方法测量并记录病斑面积，采用十字交叉法测量病斑长度，计算病斑面积及防效。病斑面积=1/4×π×病斑长径×病斑短径；防效(%)=(对照病斑面积-处理病斑面积)/对照病斑面积×100，选取防效高的JT-2F菌株进行抑菌谱测定、形态鉴定和分子学鉴定。

1.2.4 JT-2F菌株鉴定 ①形态鉴定。用划线法将JT-2F菌株接种至高氏一号培养基上，28 ℃培养约10 d，观察菌体的形态特征[25]。②分子生物学鉴定。将培养3 d的JT-2F菌株接种至40 mL不加琼脂的高氏一号培养基三角瓶(100 mL)中，于28 ℃、180 r/min振荡培养48 h后制成菌体悬浮液，离心收集菌体，采用改良的SDS裂解法用DNA提取试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取放线菌基因组DNA。采用放线菌通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')对提取的DNA进行PCR扩增(由生工生物工程(上海)股份有限公司完成)。反应体系25.0 μL：模板DNA(20～50 ng/μL) 0.5 μL，10×Buffer(含Mg2+) 2.5 μL，dNTPs(2.5 mmol/L) 1.0 μL，酶0.2 μL，上、下游引物各0.5 μL，加双蒸H2O至25.0 μL。扩增程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，进行30个循环；72 ℃延伸10 min。扩增中利用水代替DNA模板为空白对照。PCR扩增产物采用1%琼脂糖凝胶电泳检测，阳性产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行纯化测序，测序结果与GenBank的序列进行BLAST比对。

1.3 统计分析

试验数据采用SPSS 19.0进行统计分析，以MEGA 4.0的Neighbor-Joining法构建16S rDNA相似序列系统发育进化树。

2 结果与分析

2.1 拮抗放线菌的分离与筛选结果

从肿节风健康植株根系土壤中共分离得到具有拮抗活性的15株放线菌，其中，3株对肿节风炭疽病菌抑制率<60.00%，10株抑制率为60.00%～80.00%，2株抑制率>80.00%(编号分别为JT-2F和DT-3F，表1)。JT-2F菌株对肿节风炭疽病菌的抑制率最高，为86.75%，显著高于其他14株菌株(P<0.05，下同)；DT-3F对肿节风炭疽病菌的抑制率(80.54%)次之，显著高于除JT-2F和DT-6F外的其他菌株。与正常的炭疽病菌菌丝(图1-A)相比，在对峙培养中肿节风炭疽病病原菌菌丝的生长明显受到JT-2F菌株抑制(图1-B)；分别挑取培养7 d的对照组和处理组黑线炭疽菌菌丝在显微镜下观察，结果发现对照组的菌丝直且粗细均匀(图1-C)，而JT-2F菌株处理组的菌丝体发生畸变，菌丝缠绕扭曲，部分菌丝颜色变深，菌丝体膨大(图1-D)。说明JT-2F和DT-3F菌株对肿节风炭疽病菌有很好的抑菌效果(抑制率均在80.00%以上)。

表1 拮抗放线菌对肿节风炭疽病菌的抑制效果比较

2.2 拮抗菌株对肿节风炭疽病菌的离体防效

JT-2F菌株的离体防治试验结果表明，随着发酵液稀释倍数的提高防效相应降低(图2)，发酵液原液的防治效果达87.32%，且显著高于其他处理(表2)；当发酵液稀释至50倍时，防治效果下降到54.62%，稀释至100和200倍时，防效分别下降至30.08%和25.50%，防治效果不理想。

表2 JT-2F菌株发酵液对肿节风炭疽病菌的防治效果

2.3 拮抗放线菌抑菌谱

以JT-2F和DT-3F菌株对14种植物病原菌进行抑菌活性测定，结果发现JT-2F菌株的平均抑制率达81.50%，显著高于DT-3F菌株的平均抑制率(表3)。其中，JT-2F菌株对农作物病原菌的抑制率均在70.00%以上，尤其对香蕉炭疽病菌的抑制率最高，达89.41%，对西瓜枯萎病菌的抑制率虽较低，但仍达71.18%；JT-2F菌株对药用植物病菌艾纳香褐斑病菌的抑制率最高，为87.50%，对豆蔻叶斑病菌的抑制率较低，但仍达72.94%，对其他药用植物病原菌的抑制率均达到75.00%以上。可见，JT-2F菌株对肿节风炭疽病具有较好的生防应用前景。

表3 JT-2F和DT-3F菌株对14种植物病原菌的抑菌谱

2.4 拮抗菌株的鉴定结果

2.4.1 形态鉴定结果 JT-2F菌株在高氏一号培养基上开始呈白色，后期呈灰色菌落，菌落边缘呈乳白色表面褶皱，孢子卵圆形。菌丝生长旺盛，颜色为白色。

2.4.2 分子生物学鉴定结果 JT-2F菌株用通用引物16S rDNA序列进行PCR扩增和测序，获得1404 bp核苷酸序列。将该序列与NCBI中GenBank的序列进行BLAST比对，结果发现JT-2F菌株与链霉菌属(Streptomyces)同源性很高，相似度达100.0%(表4)。采用MEGA 4.0对JT-2F菌株的16S rDNA序列进行系统发育进化树构建，结果(图3)表明，JT-2F菌株与S.tsukiyonensisAB184594菌株序列在系统发育进化树上处于同一个分支，属津岛链霉菌(S.tsukiyonensis)。根据菌株的形态学特征及16S rDNA分子鉴定结果，初步鉴定JT-2F菌株为津岛链霉菌，序列登录号MK368447。

表4 系统发育进化树分析中使用的放线菌菌株序列

3 讨 论

链霉菌属是放线菌类群中的最大成员之一，具有抗菌防病功能，且抑菌谱广，可产生多种抗生素[26]，对开发生物农药和生物制剂具有潜在应用价值。已有研究表明，纤维黄链霉菌(S.celluloflavus)和S.yatensis对香蕉枯萎病菌菌丝的抑制率分别达70.12%和54.46%[27]，娄彻氏链霉菌(S.rochei)Lj20对番茄灰霉病菌具有较强的抑制作用[28]，紫黑链霉菌(S.vioiaceoniger)对山药炭疽病菌具有较好的拮抗作用[29]，杀黄孢链霉菌(S.xanthocidicus)对白色假丝酵母(Candidaalbicaus)CMCC 98001和耻垢分枝杆菌(MycobacteriumSmegmatis)MC2的抗菌活性较强[30]，新种闸坡链霉菌(S.zhapoensis)对花生青枯菌具有较强的拮抗作用[31]，放线菌S.griseinus对葡萄白腐病菌具有良好的抑制效果[32]，黄暗色链霉菌(S.xanthophaeus)Ac16抑制草莓灰霉病菌能力较强[33]，天蓝链霉菌放线菌素变种(S.coeruleofuscusvar.actinomycini)属于对常见植物病原菌(黄瓜枯萎病菌、辣椒枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、小麦赤霉病菌、玉米小斑病菌、苹果斑点落叶病菌、番茄早疫病菌和棉花黄萎病菌)有较强抑制活性的放线菌[34]。本研究从健康肿节风根际土壤中分离到1株对肿节风炭疽病菌具有较强拮抗作用的链霉菌菌株JT-2F，对14种供试病原菌(包括香蕉、烟草和西瓜等5种农作物病原真菌及三七、艾纳香、豆蔻和广西莪术等9种药用植物的病原真菌)均具较强的拮抗作用；通过形态学特性和16S rDNA鉴定，JT-2F菌株属于津岛链霉菌；离体防效试验结果显示，JT-2F菌株发酵原液对离体叶片上肿节风炭疽病的防效达87.32%。但是关于津岛链霉菌在生物防治中的作用机理、在田间的拮抗效果、对肿节风生长有无促生作用及如何与生物农药和生物制剂配合使用等仍需进一步探究。

链霉菌发酵液能产生多种次级代谢产物[24]，在生物防治中常采用液体发酵方式产生拮抗活性物质以应用于植物病害防治。段学辉等[35]研究发现，紫黑吸水链霉菌(S.violaceoniger-hygroscopicus)的发酵液对辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)、番茄灰病菌(B.cinerea)和黄瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)具有一定抑制作用。李勇等[36]研究显示，放线菌YIM31249发酵液粗提物对灰霉病菌的最小抑制浓度为0.022 mg/mL，表明发酵液中具有天然抗菌活性物质。荣晓莹等[37]研究发表明，灰色链霉菌(S.griseus)FQ-017 对苗期番茄灰霉病的防治效果较佳。本研究将JT-2F菌株在不加琼脂的培养基中发酵，发现其发酵液原液可使肿节风炭疽病菌菌丝畸形、膨大，表明JT-2F菌株发酵液中有抗生类物质产生，且发酵液在一定范围内对肿节风炭疽病菌菌丝生长的抑制效果随稀释倍数增大而减弱，与已报道的焊灰直丝链霉菌(S.chungwhensis)和紫色链霉菌(S.spurpureus)的抑菌效果相似[38-39]。

本研究仅将不加琼脂的放线菌培养液发酵后应用于肿节风炭疽病菌拮抗试验，在今后的研究中还应通过单因素和正交试验进行链霉菌发酵条件优化，以期得到最优培养条件用于后期推广应用。

4 结 论

JT-2F菌株对肿节风炭疽病菌具有较强的拮抗作用，可使炭疽病菌菌丝膨大、畸变和扭曲，抑制率达86.75%，且对14种病原真菌也具有较强的拮抗作用，平均抑制率达81.50%；其发酵原液对肿节风离体叶片上肿节风炭疽病的防效达87.32%。因此，JT-2F菌株用作肿节风炭疽病菌的生物防治材料具有较大开发和应用潜力。