聚天冬氨酸尿素及生化抑制剂对长江流域典型土壤N2O 排放的影响

刘曼霞，邢志强，张 鑫，付庆灵*，朱 俊，胡红青，赵洪涛

（1.华中农业大学资源与环境学院，湖北 武汉 430070；2.湖北三宁化工股份有限公司，湖北 宜昌 443206）

氧化亚氮（N2O）是一种能在大气中长时间稳定存在的温室气体［1］，人类活动每年造成6.7×1012g N2O-N 排放，其中农田土壤排放的N2O约占60%（IPCC 2007）［2-3］。氮肥施用是导致农田土壤大量排放N2O的重要原因之一，2017 年我国农田土壤N2O-N 排放总量约3.2×1010g，其中79.4%是源于氮肥施用［4-5］。

长江流域生态系统在我国农业生产中有着重要地位，但是该地区氮肥施用过量造成大量N2O 排放是一个不容忽视的问题。据调查显示，在长江流域农民氮肥施用量为N 36～345 kg·hm-2，超出氮肥推荐施肥量20%以上［6］。因此，探讨如何减少长江流域不同地区N2O 排放，提高氮肥利用率，具有十分重要的意义［7］。

氮肥与脲酶抑制剂、硝化抑制剂或二者复合使用对减少N2O 排放具有较好的作用［8-9］。脲酶抑制剂可以有效减缓尿素的水解，从而抑制尿素向铵态氮的转化［10-11］。硝化抑制剂通过抑制硝化和反硝化过程，从而减少N2O 排放［10-11］。在众多脲酶抑制剂的研究中，N-丁基硫代磷酰三胺（NBPT）被证实在大田和培养实验中均有显著抑制脲酶活性的作用［12-15］。3，4-二甲基吡唑磷酸（DMPP）减少N2O 排放的作用效果在许多研究中得到证实［16］，其在低剂量下就可达到较好效果［17］，并且经检测无生化毒性［18］。

提高氮肥利用率的另一有效途径是使用新型尿素替代普通尿素［19-20］。聚天冬氨酸（PASP）是一种可降解的有机聚合物，可与普通尿素复配制成新型尿素（PASP 尿素），许多研究证实，PASP 尿素对植物吸收N、P、K 等营养元素具有一定促进作用，并且可以吸附NH4+，有利于尿素缓慢、持续供应养分［21-22］。

但是，关于PASP 尿素在长江流域不同地区土壤中的作用效果和DMPP、NBPT 以及二者联用对降低长江流域地区土壤N2O 排放和提高氮的利用率的相关研究甚少，更无长江流域不同地区土壤间的对比研究。

本文以长江上游四川紫色土、长江中游湖北黄棕壤性水稻土和长江下游浙江青泥田水稻土为研究对象，通过不同尿素（普通尿素、PASP 尿素）与抑制剂（DMPP、NBPT）联合施用，对比研究：1.新型尿素较普通尿素的优越性；2.NBPT 和DMPP 对长江流域不同土壤N2O 排放的影响；3.抑制剂与新型尿素联用的作用效果。探讨长江流域不同地区供试土壤氮转化的特点和氮肥减损增效效果，为减少该地区N2O 排放、指导农业生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试土壤

供试土壤分别是：长江上游四川省绵阳县（105°27′E，31°16′N）紫色土，前茬作物为玉米；长江中游湖北省广水市（113°53′E，31°16′N）黄棕壤性水稻土，前茬作物为水稻；长江下游浙江省平湖市（121°1′E，30°38′N）青泥田水稻土，前茬作物为水稻。

3 个大田均按5 点取样法，用铁锹采集0～20 cm 耕层土壤，去除石砾和动植物残体后将所取土壤混合，之后将土壤自然风干。四分法取一部分土壤过2 mm 孔径筛，于-20℃冰箱中保存备用；另一部分土壤用于测定理化性质［23］，各地区供试土壤基本理化性质见表1。

表1 供试土壤基本理化性质

1.1.2 供试肥料与抑制剂

供试肥料有普通尿素和聚天冬氨酸尿素（PASP 尿素），其中PASP 尿素由湖北三宁化工股份有限公司提供，含氮量为46%，和普通尿素相同。供试抑制剂包括硝化抑制剂3，4-二甲基吡唑磷酸（DMPP，C5H11N2O4P）和脲酶抑制剂N-丁基硫代磷酰三胺（NBPT，C4H14N3PS），均购自上海源叶生物科技公司。

1.2 试验设置

为了探讨硝化抑制剂和脲酶抑制剂对供试土壤中尿素转化的影响和添加不同尿素的N2O 排放差异，将采自不同地区的土壤在相同条件下进行培养试验，每一土壤均设置8 个处理，每个处理进行3 次重复，其中添加普通尿素的4个处理为：U（普通尿素）、U+D（普通尿素+DMPP）、U+N（普通尿素+NBPT）、U+D+N（普通尿素+DMPP+NBPT）；另外添加PASP 尿素的4 个处理为：P（PASP 尿素）、P+D（PASP 尿素+DMPP）、P+N（PASP 尿素+NBPT）、P+D+N（PASP尿素+DMPP+NBPT）。其中普通尿素和PASP 尿素的添加量均为N 0.1 g·kg-1干土；DMPP 和NBPT用量分别是施入氮的2%和0.2%。

预培养时，称取1 kg 土样（干重）于培养盘中，保持田间最大持水量20%的含水量，于25℃条件下在人工气候培养箱中培养10 d 以复苏土壤微生物［1］。在此期间保证良好通气，每隔1～2 d按称重法滴加超纯水补充流失的水分。预培养结束后，将土壤按照每瓶35 g 干土分别装至250 mL 培养瓶中，并按照试验设置添加相应的尿素和抑制剂，调节水分至田间最大持水量60%，于25℃条件下在人工气候培养箱中持续培养21 d［1］。

正式培养的第1、3、5、7、10、14 和21 d 用气密性注射器进行首尾两次取气，测定其N2O 浓度，并且每次取气结束后记录相应时间。完成第二次取气后，打开培养瓶用称重法补水，并充分换气约2 h。同时取大约1.5 g 干土至15 mL 离心管中，用于测定土壤中NO3-、NH4+浓度（每次取土后，按称重法计算培养瓶内实时土重，以便于后续N2O 排放计算）。取样结束后，盖上瓶盖放回培养箱继续培养。

以上采集的气体样品使用气象色谱仪（Agilent GC7890A）分析N2O 浓度。土壤样品用2 mol·L-1的氯化钾溶液浸提NO3-、NH4+，使用AA3 连续流动分析仪测定浓度［24］。

1.3 N2O 释放速率与累积排放量计算

根据培养开始后不同时间测定的N2O 浓度，使用Slope 函数计算N2O 浓度随时间变化的曲线斜率，选择R2＞0.9的数值，按下式计算N2O-N 释放速率：

式 中：F 为N2O-N 释放速率（μg·kg-1·h-1）；dc/dt 为培养瓶中N2O 浓度随时间线性变化的曲线斜率（μL·L-1·h-1）；V 为培养瓶内气体体积（L）；W为干土质量（kg）；ρ为标准状况下N2O 气体的密度（ρ=1.978 g·L-1）；T 为培养温度（K）；α为N2O 换算为N的转化因子（28/44）。

按下式计算N2O-N 累积排放量：

式中：C 为N2O-N 累积排放量（μg·kg-1），为两次取气间隔时间内N2O-N 平均释放速率（μg·kg-1·h-1），ti为两次取气间隔时间（h）。

1.4 数据分析

使用Excel 2010 汇总计算数据、Origin 2018C绘图、SPSS 25 进行方差分析和最小显著性差异法（LSD）比较不同处理之间N2O 释放量。

2 结果与分析

2.1 N2O 释放速率

四川紫色土不加抑制剂的处理N2O 释放速率先增加后减小，并在第3 d 达到最大值，N2O-N 48.30 μg·kg-1·h-1（U）和N2O-N 61.08 μg·kg-1·h-1（P），第7 d 后趋于0（图1a）。添加抑制剂后N2O释放速率均有所降低，含有DMPP的处理5 d 后趋于0，添加NBPT的处理7 d 后趋于0。该地区土壤相同处理条件下，添加PASP 尿素比普通尿素的N2O 释放速率大。

湖北黄棕壤性水稻土所有处理N2O 释放速率均呈现下降趋势。含有DMPP的处理N2O 释放速率5 d 后趋于0。不添加抑制剂的处理和仅添加NBPT的处理N2O 释放速率7 d 后趋于0。相同抑制剂处理下，施用PASP 尿素土壤N2O 释放速率整体上低于施用普通尿素（图1b）。

浙江青泥田水稻土不加抑制剂的处理，N2O释放速率先增加后减小，并在第3 d 达到最大值，N2O-N 10.28 μg·kg-1·h-1（U）和N2O-N 8.60 μg·kg-1·h-1（P），第14 d 后趋于0，并且施用PASP 尿素的处理N2O 释放速率均低于施用普通尿素的处理对应的N2O 释放速率。仅添加NBPT的处理N2O 释放速率先减小再增加，在第7 d 达到最大值N2O-N 5.39 μg·kg-1·h-1（U+N）和N2O-N 6.08 μg·kg-1·h-1（P+N）后又减小，14 d 后趋于0。含有DMPP的处理N2O 释放速率接近0（图1c）。

2.2 N2O 累积排放量

四川紫色土含有DMPP的处理，N2O 排放总量降低了70%～86%，其中仅添加DMPP 效果更佳，可降低80%～86% N2O 排放。仅添加NBPT的处理N2O 排放总量比不添加抑制剂的处理降低14%～22%（图2a）。

湖北黄棕壤性水稻土仅添加NBPT的处理N2O 排放总量比不添加抑制剂的处理高出4%～46%。含有DMPP的处理，N2O 排放总量降低了7%～53%，其中组合抑制剂效果更佳，降低幅度达30%～53%（图2b）。

浙江青泥田水稻土仅添加NBPT的处理，N2O 排放总量比不添加抑制剂的处理降低了26%～60%。含有DMPP的处理，N2O 排放总量降低96%以上，单加DMPP 抑制效果更强，几乎无N2O 排放（图2c）。

在3 个地区土壤中均表现出：抑制剂对降低施用普通尿素的处理N2O 排放具有更好的效果，相同处理下，抑制剂对普通尿素N2O 排放的减少量多于PASP 尿素。在湖北黄棕壤性水稻土和浙江青泥田水稻土中，在不使用抑制剂的情况下，施用PASP尿素其N2O 排放总量比施用普通尿素低40%。

总体上N2O 排放总量表现为湖北黄棕壤性水稻土＞四川紫色土＞浙江青泥田水稻土。

长江流域3 个典型土壤N2O 排放总量的分析（表2）显示，施用不同肥料土壤N2O 排放总量具有显著差异，使用不同抑制剂对土壤N2O 排放总量的影响也具有显著差异，不同土壤经相同处理其N2O 排放总量也具有显著差异。交互分析结果显示，不同处理和不同土壤对N2O 排放总量的交互作用也具有显著差异。

表2 长江流域不同典型土壤N2O 排放总量（N2O-N μg·kg-1）

2.3 土壤中铵态氮含量

四川紫色土所有处理随着培养时间增长，土壤中NH4+-N 含量逐渐增加。湖北黄棕壤性水稻土所有处理随着培养时间增长，土壤中NH4+-N 浓度总体呈下降的趋势。浙江青泥田水稻土所有处理随着培养时间增长，土壤中NH4+-N 含量先增加后减小，培养结束时降到初始值以下（图3）。

四川和湖北供试土壤含DMPP的处理中NH4+-N 含量较高，在第5～7 d 富集最多，土壤中NH4+-N 浓度可达90～120 mg·kg-1。含NBPT的处理土壤中NH4+-N 浓度比不添加抑制剂的处理低。浙江供试土壤含DMPP的处理土壤中NH4+-N含量较高，含NBPT的处理培养3～10 d 后，土壤中NH4+-N 浓度比不添加抑制剂的处理要高10%～50%。

四川紫色土和浙江青泥田水稻土在相同处理下，施用PASP 尿素土壤NH4+-N 含量略高于施用普通尿素土壤NH4+-N 含量（除浙江青泥田水稻土仅添加NBPT的处理）。湖北黄棕壤性水稻土NH4+-N 含量均较低，施用普通尿素和PASP 尿素土壤NH4+-N 含量相当。总体而言，土壤中NH4+-N 含量表现为四川紫色土＞浙江青泥田水稻土＞湖北黄棕壤性水稻土。

2.4 土壤中硝态氮含量

总体上土壤中NO3--N 含量表现为：四川紫色土＞浙江青泥田水稻土＞湖北黄棕壤性水稻土，3 个供试土壤不含DMPP的处理NO3--N 含量较高（图4）。

四川紫色土不含DMPP的处理NO3--N 含量随着培养时间增长缓慢升高，含有DMPP的处理NO3--N含量随着培养时间增长升高较快。在培养结束时所有处理中NO3--N 含量逐渐接近，所有处理的NO3--N浓度值均在160 mg·kg-1附近（图4a）。

湖北黄棕壤性水稻土不含DMPP的处理NO3--N含量随着培养时间增长先升高后降低，在第7 d 达到最高浓度10～13 mg·kg-1，但培养结束时NO3--N 浓度仍高于起始值。含有DMPP的处理NO3--N 含量随着培养时间增长缓慢升高并保持上升趋势（图4b）。

浙江青泥田水稻土所有处理NO3--N 含量均随着培养时间增长而升高，培养结束时的浓度是起始浓度1.2～3.2 倍（图4c）。

3 个供试土壤在不添加抑制剂的情况下，施用PASP 尿素土壤NO3--N 含量总体上高于施用普通尿素的处理，其中湖北黄棕壤性水稻土NO3--N 含量高出部分达20%～50%。添加抑制剂后，四川紫色土施用PASP 尿素的处理其NO3--N 含量也略高于普通尿素，但湖北黄棕壤性水稻土和浙江青泥田水稻土中NO3--N 含量差异不稳定。

3 讨论

DMPP 对降低长江流域3 个地区供试土壤N2O排放具有较好的效果，同时降低了土壤中NO3-含量。与之相反，3 个供试土壤中添加DMPP 后NH4+含量比其他处理高。有研究表明，硝化抑制剂的使用会抑制亚硝化细菌的生长，降低氨单加氧酶活性［25-26］，从而抑制氨氧化过程中NH4+向NO2-的转化，但是不影响后续反应过程［27］。就本试验而言，使用DMPP 后有效抑制NH4+向NO2-的转化，使得NH4+在土壤中积累，并减少了NO2-向NO3-和N2O的转化。

在四川紫色土和浙江青泥田水稻土中，添加NBPT 对抑制N2O 排放也具有一定的作用。但是在湖北黄棕壤性水稻土中，添加NBPT的处理N2O 排放量反而增加了，这可能是因为该地土壤偏酸性，而NBPT 在酸性土壤中更容易降解，在非酸性土壤中才能较好发挥抑制尿素水解的作用［28-29］。另外，土壤中脲酶主要由植物、微生物分泌，土壤有机质含量增高会促进微生物活性［10］，湖北黄棕壤性水稻土有机质含量较高，有利于微生物分泌脲酶，故NBPT的抑制效果不佳。

四川和浙江地区供试土壤仅添加DMPP 抑制N2O 排放效果最佳，而湖北黄棕壤性水稻土中，DMPP 和NBPT 配施效果最好。这可能是因为，尿素水解为NH4+释放一分子OH-，但是NH4+氧化成NO3-释放两分子H+，从而使土壤酸化，而硝化抑制剂减弱了氨氧化作用，可以延缓土壤酸化，使土壤pH 值升高［30-31］，从而更适合NBPT 发挥作用，二者联用加强对N2O 排放的抑制效果。由前人的研究得知，DMPP 会通过影响氨氧化微生物的丰度来影响土壤N2O的排放［32］，并且土壤中Cu2+含量也会影响氨氧化酶的活性［33］。因此，两种抑制剂在不同土壤中的作用效果差异可能由土壤性质、微生物作用等因素不同所致，后期可深入研究不同处理下、不同土壤中微生物的功能差异，从而深入分析土壤氮转化机理。

3 个供试土壤施用PASP 尿素后，土壤N2O释放速率相较于施用普通尿素有所降低，印证了PASP 尿素具有缓慢降解的效果［20-22］。在不使用抑制剂的情况下，湖北黄棕壤性水稻土和浙江青泥田水稻土施用PASP 尿素的处理相较于施用普通尿素，其土壤N2O 排放总量显著降低，但与抑制剂联用后效果不明显。施用PASP 尿素的土壤中NH4+-N、NO3--N 含量均高于施用普通尿素，提高了氮肥潜在的有效性［34］。结合PASP的分子特性分析，PASP 尿素发挥作用主要是由于可以固持NH4+，可能对减少氨挥发造成的氮损失具有较好的作用。而氨挥发受温度、水分、通气条件等因素影响较大［35］，而本试验在培养过程中保持相同的温度和持水量，未测定土壤氨挥发指标，因此要合理评估PASP 尿素的减损效果还需进一步研究其施用对氨挥发的影响。

本研究主要通过测定N2O 和土壤中不同形态的氮来分析添加的抑制剂对长江流域不同土壤和不同种类肥料的作用效果以及施用普通尿素和PASP 尿素土壤氮转化的差异，但是具体分子调控机制尚不明确，后续可结合不同培养体系中微生物的响应进一步探讨氮素转化机理和抑制剂作用效果。

4 结论

综合以上结果，本研究初步得出以下结论：（1）使用PASP 尿素替代普通尿素对于减少土壤N2O 排放有一定效果。（2）硝化抑制剂DMPP 有效抑制了长江流域不同地区土壤中氨氧化过程；减少了N2O 排放，缓解了温室气体造成的危害；减少了土壤中NO3-含量，降低了淋溶造成氮损失的风险。（3）脲酶抑制剂NBPT 在四川、浙江碱性土壤中对减少N2O 排放也具有一定作用。