杀伤性T细胞来源的蛋白激酶在胰腺癌中的表达及临床意义*

陈军梅 林 萱

胰腺癌是一种起病隐匿、恶性程度极高的消化系统肿瘤，发病率在全身恶性肿瘤中占比约1%-2%[1]，且近年有逐年升高趋势。由于缺乏早期发现和有效干预,胰腺癌患者5年生存率不足8%[2]，亟需寻找早期诊断的生物学标志物及有效治疗靶点以改善预后。

杀伤性T细胞来源的蛋白激酶(T-lymphokine-activated Killer Cell-originated Protein Kinase,TOPK)是一种丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，与果蝇肿瘤抑制蛋白Dlg的人类同源物分子PDZ结构域相结合的蛋白激酶--PDZ结合激酶(PDZ Binding Kinase，PBK)属同一分子，统称为PBK/TOPK[3]。TOPK在细胞周期调控和有丝分裂中发挥重要作用,在分化细胞中的表达很低，其过度表达是许多肿瘤的病理生理学特征[4]。Hinzman等[5]利用已建立的功能获得与功能丧失研究和患者来源的异种移植物--胰腺导管腺癌细胞系，并检测患者的档案组织样本，首次证实PBK/TOPK在胰腺癌中表达上调，其表达水平与胰腺癌细胞的侵袭性密切相关。本研究通过免疫组化染色法检测TOPK蛋白在70例胰腺癌组织中的表达，分析不同表达水平在临床病理特征分布及与患者生存率和不良预后的关系。

1 资料与方法

1.1 病例资料和分组

所有患者在术前均未接受过放、化疗或者生物学治疗，且对参与的研究均知情同意。组织芯片病理分型诊断参照WHO胰腺肿瘤组织学分类(2019年第5版)[6]，含导管腺癌、腺泡细胞癌各32例，粘液性囊腺癌3例，胰母细胞瘤1例，腺鳞癌1例、神经内分泌癌1例，共70例(胰腺癌组)；以及随机选取的胰腺癌癌旁正常组织10例(对照组)，每例1个组织块。胰腺癌样本的病理分级参照2017欧洲神经内分泌肿瘤学会共识[7],G1级14例，G1级-G2级4例、G2级21例，G2级-G3级3例、G3级23例；不能评估级别者5例。按照国际抗癌联盟(UICC)颁布的胰腺癌TNM分期(2018年第8版)[8]，本次胰腺癌样本的T分期中T1 3例，T2 39例,T3 25例，T4 3例，N分期中N0 55例，N1 15例，M分期中M0期70例；TNM分期中IA期3例，IB期32例，IIA期18例，IIB期14例，III期3例。胰腺癌组病例年龄23-80岁，平均年龄54.4岁，中位年龄54岁；男性42例，女性28例。对照组年龄23-42岁，平均年龄37.7岁，中位年龄40岁；男性5例，女性5例。

1.2 主要试剂和仪器

胰腺癌组织芯片(货号PA804a，生产批次20190329)购自西安百思达生物科技有限公司;小鼠TOPK抗体(圣克鲁斯生物技术上海有限公司，编号sc-393313)，生物素标记的二抗DAKO(安捷伦科技有限公司，编号K5007)；无水乙醇(批号10009218)、二甲苯(批号10023418)、磷酸盐缓冲液(批号KDX05)均为国药集团化学试剂有限公司产品；柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)(无锡傲锐东源生物科技有限公司，编号ZL1-9065)、3,3'-二氨基联苯胺(美国Sigma-Aldrich公司，批号D5637)，苏木精(美国Sigma公司，批号H9627)。

组织摊片烤片机(武汉俊杰电子有限公司，型号JK-6)，抗原修复用微波炉(广东美的电器有限公司，型号KJ23B(C)-AN)，生物显微镜(日本Olympus公司，型号BX53)。

1.3 免疫组化染色和评分

胰腺癌组织芯片经二甲苯脱蜡并梯度乙醇水化、柠檬酸盐缓冲液高压修复1.5min后在室温下用过氧化氢(0.3%)对内源过氧化物酶失活10min，磷酸盐缓冲液冲洗3次。用抗TOPK抗体(稀释度1∶200)室温孵育1h后加入生物素标记的二抗DAKO孵育30min，3,3'-二氨基联苯胺室温染色后苏木精复染5min，脱水后透明封片。

TOPK蛋白在细胞质、细胞核中呈现黄色或棕黄/褐色颗粒为阳性表达，由两名病理科副主任以上医师判读。高倍镜下(×400)每个样本计数100个细胞，按其染色强度和阳性细胞百分率进行评分。染色强度评分：无着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分;阳性细胞百分率评分：<5%为0分，6%-25%为1分，26%-50%为2分，51%-75%为3分，>75%为4分。两项评分值乘积为TOPK表达最终结果：0分为不表达，1-2分为低表达，3-6分为中等表达，>6分为高表达。

1.4 统计学处理

应用SPSS 21.0统计学软件。计数资料的比较采用秩和检验或χ2检验，Cox回归模型进行单因素及多因素分析，Kaplan-Meier法绘制生存曲线，Log-rank法比较组间生存差异。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 胰腺癌组与对照组TOPK蛋白表达比较

胰腺癌组TOPK蛋白表达评分结果为：1例不表达(1.43%)，33例低表达(47.14%),31例中表达(44.29%)，5例高表达(7.14%)；对照组8例不表达(80.00%),2例低表达(20.00%)。经秩和检验，两组TOPK蛋白表达评分差异有统计学意义(P<0.01)。见图1，表1。

注：正常胰腺组织导管和腺泡结构规则，无TOPK蛋白显色(A)或仅呈浅黄色(占比<25%，B)。胰腺癌组织导管和腺泡大小不等，结构紊乱，形态各异，无TOPK蛋白显色仅1例(C)，棕黄色阳性细胞占比<25%(D)、棕褐色阳性细胞占比25%-50%(E)以及棕褐色阳性细胞占比>75%(F)

表1 胰腺癌组与对照组TOPK蛋白表达比较(n)

2.2 胰腺癌组不同TOPK蛋白表达水平患者临床病理特征分布比较

胰腺癌患者TOPK表达亚组间不同性别、年龄、T分期、N分期、病理分级及病理类型分布无统计学差异(P>0.05)，只有不同TNM分期的分布差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 胰腺癌组不同TOPK蛋白表达水平的临床病理特征比较

2.3 不同TOPK表达水平与胰腺癌患者生存比较

2016-01-2020-01采用电话随访70例胰腺癌患者，其中存活9例，死亡61例(均死于胰腺癌)。

Log-rank检验结果显示，TOPK中/高表达亚组患者平均生存期低于无/低表达亚组，有统计学意义(P<0.01)。见图2，表3。

图2 不同TOPK表达水平胰腺癌患者生存曲线

表3 TOPK无/低表达患者与中/高表达患者生存时间比较

2.4 胰腺癌患者预后因素回归分析

Cox回归单因素与多因素分析结果显示，TNM分期、TOPK蛋白表达水平为胰腺癌患者的不良预后因素(P<0.01)。见表4，表5。

表4 影响胰腺癌患者预后的单因素分析

表5 影响胰腺癌患者预后的多因素回归分析

3 讨 论

组织芯片又称组织微阵列，是将数十个乃至上千个组织样本整齐地排列在同一张载玻片上制成的微缩组织切片,具有体积小、信息量大、操作统一、对比性强等优点。本研究采用组织芯片研究胰腺癌组织TOPK蛋白的表达，结果显示TOPK蛋白在胰腺癌组织中的表达明显高于癌旁正常胰腺组织；TNM分期较高的胰腺癌组织，其TOPK蛋白表达明显增加。TOPK高表达患者平均生存期缩短，而且是胰腺癌不良预后的危险因素。

PBK/TOPK是丝裂原活化蛋白激酶家族成员之一，在正常成年男性的睾丸组织表达最高[9]。TOPK在胃癌[10]、肺癌[11]、结直肠癌[12]、急性髓细胞白血病[13]、胶质瘤[14]、甲状腺癌[15]、原发性中枢神经系统淋巴瘤[16]等多种肿瘤中高表达，在肿瘤细胞的有丝分裂中起着不可或缺的作用[17]。有Meta分析显示，在各种癌症中，PBK/TOPK蛋白高表达患者的无复发生存期低，无病生存期短[18]。PBK/TOPK这种强烈的恶性作用是通过多环节实现的：(1)能强烈促进细胞分裂[19]。PBK/TOPK与细胞有丝分裂纺锤体的形成相关[20]，在细胞有丝分裂期被磷酸化激活，于G2期、M期的表达上调，与细胞周期蛋白B1变化一致，并通过促进细胞周期蛋白依赖性激酶1(Cylcin-dependent Kinase 1,CDK1)/Cyclin B1复合体的表达，磷酸化多梳抑制复合物1(Polycomb Repressive Complexes 1，PRC1)，加快细胞有丝分裂[19]。PBK/TOPK还可结合抑癌因子p53 的DNA 结合结构域，抑制下游细胞周期调控蛋白功能，导致异常有丝分裂，促进肿瘤形成[21]。(2)持续维持致癌底物的磷酸化，使癌细胞绕过调控检查点控制，促进肿瘤生长[22]。(3)调控或激活PI3K/AKT/ERK1/ERK2 信号通路[23]、PBK/PTEN 和ERK通路[24]、β-catenin-TCF/LEF[25]等多条细胞内信号通路，促进基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinase，MMP)-2、 MMP-9等多种细胞因子表达，引起机体内一系列肿瘤基因或转录因子表达量发生变化，提高肿瘤细胞的存活、增殖、侵袭、迁移及抗凋亡能力[3]。已有研究发现[5]，PBK/TOPK通过调节MMP-2、MMP-9的转录过程，并提高调控MMP-2、MMP-9转录的重要调节因子—癌基因cMYC的稳定性，加速MMP-2、MMP-9降解细胞外基质，从而促进胰腺癌细胞侵袭和转移。

综上所述，胰腺癌患者TOPK蛋白表达增强，且与患者生存期及不良预后有关，进一步丰富了TOPK与胰腺癌关系的研究结果，但本研究中无远处转移病例，故TOPK蛋白在有远处转移胰腺癌组织中的表达情况尚待继续观察。

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