基于网络药理学探讨丹红注射液治疗银屑病的作用机制

吴燕瑜，齐俊南

江西中医药大学附属医院，江西 南昌 330006

银屑病是一种以斑块、鳞屑为主要表现的慢性皮肤病，其主要发病机制为表皮的过度增厚及免疫反应［1］。本病主要分为寻常型、关节型、脓疱型、红皮型四型，而寻常型银屑病发病率占90%以上［2］。近年来，随着中成药的应用，不仅拓宽了治疗银屑病的思路，也使银屑病的治疗效果得到了提高。丹红注射液是丹参和红花的提取物［3］，据中医理论，丹参和红花在活血化瘀通络方面是相须为用的，二者联合应用加强了活血化瘀的作用，因此，丹红注射液广泛应用于心脑血管等疾病［4-6］。针对其凉血活血的功效，本研究通过网络药理学探究丹红注射液治疗银屑病的作用机制。

1 方法

1.1 药物成分检索及收集

通过使用中药系统药理学数据库及分析平台（TCMSP，http://tcmspw.com/index.php）分别检索“丹参”“红花”，设定阈值为OB（口服生物利用度）≥30%，DL（化合物类药性）≥0.18，筛选并收集两个药物的有效成分。

1.2 活性化合物标靶蛋白的筛选

使用PubChem 有机小分子生物活性数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）查找活性化合物的2D结构图，将化合物的2D 结构图导入Swisstargetprediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）进行靶标蛋白检索，物种选择为智人（Homo sapiens）。

1.3 疾病靶点的筛选

使用Gencards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/）等数据库，以“psoriasis”为关键词进行检索，检索银屑病的相关基因。

1.4 基因名称的标准化以及化合物-基因靶点的网络的构建

使用Uniprot（https://www.uniprot.org/）数据库查询靶标基因的标准化名称，将药物化合物、靶标基因导入cytoscape 3.8.0 软件中构建药物-化合物-基因靶点网络图，并分析化合物与靶点之间的度值。

1.5 交集基因的筛选及其蛋白质网络的构建

将丹参和红花的基因靶点和银屑病的基因靶点输入在线作图工具（venny 2.1，https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）查找药物化合物与银屑病的交集基因。将得到的核心蛋白基因导入到string 在线作图软件，获取蛋白互作关系网络图。

1.6 核心靶点的通路分析

把选定的丹参、红花对治疗银屑病的核心靶基因导入 DAVID 数据库（https://david.ncifcrf.gov/），对所有靶基因进行官方名称（official gene symbol）校正；设定清单类型为基因列表（Gene List），物种设置为智人（Homo sapiens）。对BP（Biological process）生物学过程进行富集分析，在 Pathways 模块中进行基于京都基因与基因百科全书（KEGG）代谢通路富集分析，设定阈值为P＜0.05。并将数据导入绘图网站 Omishare Tools（http：//www.omicshare.com/tools/Home/Index/index.html）将数据结果可视化。

2 结果

2.1 药物活性化合物的筛选

从TCMSP 平台中检索丹参、红花共得到化合物113 个（丹参202 个、红花189 个）化合物，经过筛选后得到有效活性化合物87 个，通过检索这87 个活性成分的蛋白靶点，将数据导入cytoscape 3.8.0 软件中使用network analysis 工具进行度值计算，选取degree 值≥9 的共46 个活性成分进行分析。详见表1。

表1 丹红注射液活性成分表

2.2 药物-成分-靶点网络的构建

将筛选出的46 个活性化合物（其中有两个未获取到基因靶点），整理得到基因靶点共228 个，利用Cytoscape 软件构建丹红注射液药物-成分-靶点图，共有节点275 个，共1 223 个相互作用关系，见图1。筛选出前5 的化合物为quercetin（槲皮素）、luteolin（木犀草素）、kaempferol（山柰酚）、tanshinone iia（丹参酮iia）、salviolone（丹参酮），前五的靶点为PTSG2、ADRB2、SCN5A、PTSG1、CHRM3。详见表2，3。

图1 药物-成分-靶点网络图

表2 药物的degree值前5的活性成分

表3 药物的degree值前5的作用靶点

2.3 疾病靶点的筛选

在 GeneCards 数据库和OMIM数据库以“psoriasis”为关键词，筛选银屑病相关的疾病靶点基因信息，去重后共收集到银屑病靶点基因3 753 个。

2.4 获取药物与疾病的交集基因

将丹红注射液的228 个靶点和银屑病的3 753个靶点输入Venny 2.1 在线软件作图工具平台绘制韦恩图，两者交集为疾病-类药活性成分共同靶点，共132 个，见图2。

图2 银屑胶囊和银屑病共同基因靶点

2.5 丹红注射液与银屑病的蛋白互作PPI 图

将核心基因导入string 数据库中，选择物种为智人，最低交叉互作分数设置为0.9，得到蛋白互作PPI图共有132 个点，659 条边，平均度值为9.98，点越大，连接线条越粗，表明互作关系越多，见图3。主要的蛋白基因是STAT3、AKT1、JUN、TP53 等，见图4。

图3 核心基因蛋白PPI互作图

图4 通过string数据库分析degree值前20的基因靶点柱状图

2.6 核心基因标靶的富集分析

将交集基因导入DVID 数据库中，进行关于BP、CC、MF 和KEGG Pathways 生物过程的富集分析中，按照频率排序，筛选出前20 个关于GO 富集分析，主要是作用于细胞的组成，见图5。并根据通路上基因的数量对KEGG Pathways 进行排序，发现银屑病与癌症、乙肝、丙肝都有一定的联系，丹红注射液治疗银屑病主要通过PI3K-Akt、TNF、MAPK、HIF-1 等信号通路。见图5。

图5 GO富集分析生物过程柱状图

2.7 KEGG pathway 分析

将核心基因导入KEGG 数据库中进行分析，其中在PI3K-Akt 信号通路上共有32 个基因，主要集中在该通路的下游基因。对于银屑病现在比较热门的TH17 细胞分化通路上，一共有22 个基因，主要表现为上游基因进行调控，通过IL-1β、TGF-β、IL-6、IFN-γ、IL-2、IL-4 等因子进行调控下游蛋白进而调节TH17 细胞的分化。详见图7，8。

图7 PI3K-Akt信号通路图

3 讨论

图6 KEGG pathway富集分析气泡图

中医学称银屑病为“白疕病”，是一个难治性、易复发的疾病，《医林改错》云:“血受热则煎熬成块。”阐述了银屑病患者初起血热为主，热邪煎熬血液导致血瘀。《素问·痹论篇》云:“病久入深，荣卫之行涩，经络时疏，故不通。”表明了久病则气滞血瘀，经络堵塞，形成血瘀。其中斑块状银屑病患者表现为皮肤甲错，瘙痒不适，皮疹暗红色，为血瘀的表现。庄国康提出“肥厚是瘀、色红是热”的辨证要点［7］。赵炳南认为本病夏轻冬重明显的季节性，主要是因为寒燥闭阻肌肤，瘀毒不得化，风邪不能散而形成的［8］。禤国维从燥毒瘀论治本病［9］，徐宜厚将银屑病的病理过程归纳为血热—血燥—血瘀，认为血瘀为其病理转化的主轴［10］。可见血瘀证在银屑病的发病过程中具有重要的作用。丹红注射液由丹参、红花2 味药物组成，具有凉血活血的作用。通过网络药理学分析可以发现丹红注射液通过多个基因靶点、多条通路进行作用治疗银屑病。

丹红注射液中重要的成分是：槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、山柰酚（kaempferol）、丹参酮iia（tanshinone iia）、丹参酮（salviolone）。槲皮素可以通过NF-κB 途径改善银屑小鼠模型皮炎反应［11］，同时还可以降低炎症因子IL-6 和TNF-α 的表达［12-13］，木犀草素可通过减少INF-γ 的分泌，抑制外周血TH1 和TH17 的增加，减轻银屑病的皮损和炎症反应［14］。同时，木犀草素还可以抑制银屑病角质细胞增殖［15］。在使用ImQ 诱导的银屑病小鼠模型中，发现山柰酚可以降低银屑病皮损的CD3+T 细胞的浸润，降低IL-6、IL-17A、TNF-α的基因表达，并下调了NF-κB 信号［16］。丹参酮IIA 可以诱导银屑病靶细胞角质形成、细胞周期阻滞和凋亡的细胞机制［17］,还可以降低脂质过氧化物的含量,具有抵抗氧自由基和调节免疫等作用［18］，能够治疗银屑病。丹参酮可抑制抗原淋巴结细胞和激活的巨噬细胞产生IFN-Y 和IL-12［19］,还可以抑制肥大细胞脱颗粒，减少炎症反应［20］。

图8 TH17 细胞分化信号通路图

药物-成分-靶点网络发现药物主要是通过作用于PTSG2、ADRB2、SCN5A、PTSG1、CHRM3进行作用。PTGS2 又称（COX-2）环氧化酶-2，COX-2 可促进细胞增殖、抑制细胞凋亡［21］，同时COX-2 还是HIF-1 的下游基因，协同促进角质细胞增殖并出现表皮角化不全，棘层肥厚和真皮乳头毛细血管增生［22］，表现为银屑病的组织病理变化。通过DAVID 数据库分析，发现丹红注射液主要通过PI3K-Akt、FoXO、TNF、MAPK、HIF-1 等信号通路对银屑病进行作用。PI3K/Akt 信号转导通路是细胞存活的重要通路［23］，银屑病皮损中PI3K 基因及其亚单位PI3K-P110 蛋白的表达特异性增高［24］，Akt 的高表达可导致下游的FoxO 蛋白磷酸化水平升高，进而作用于下游的细胞周期调控蛋白Cyclin和CDK，使角质细胞出现过度增殖的病理变化［25］。同时PI3K-Akt 还可以下调靶蛋白mTOR，高度活化的PI3K/Akt/mTORC1 可抑制角质形成细胞的细胞核自噬功能，导致表皮出现角化不全的病理变化［26］。通过MAPK 信号通路可以抑制NF-κB 和AP-1 的磷酸化，发挥抗炎作用［27］，也是连接细胞对外界刺激反应的重要信号转导通路［28］。

综上所述，丹参注射液治疗银屑病具有多靶点、多通路作用，为研究丹参注射液治疗银屑病的作用机理提供了思路。但网络药理学仅仅是理论上的探讨，还需通过实验进行验证。