高效液相色谱法测定化妆品中甲基氯异噻唑啉酮的不确定度分析

程红新 陆军

【摘要】 本文对高效液相色谱法测定化妆品中甲基氯异噻唑啉酮含量进行了不确定度分析，计算出样品含量为0.000991%时的合成不确定度和扩展不确定度。

【关键词】 不确定度;甲基氯异噻唑啉酮;化妆品;高效液相色谱法

【DOI编码】 10.3969/j.issn.1674-4977.2021.04.017

Analysis of Uncertainty in Determination of 5-Chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one in Cosmetic

CHENG Hong-xin，LU Jun

（Liaoning Institute for Drug Control，Shenyang 110036，China）

Abstract： The uncertainty of determination of 5-Chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one in cosmetic using high performance liquid chromatography was analyzed in this paper. When the 5-Chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one content in the sample was 0.000991%，the combined uncertainty and extended uncertainty were calculated.

Key words： uncertainty;5-Chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one;cosmetic;high performance liquid chromatography

化妝品中因含有大量的水分、营养物质，易滋生细菌、真菌等微生物，故一般使用防腐剂，确保其使用安全。甲基氯异噻唑啉酮（5-Chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one，简称MCI）与甲基异噻唑啉酮（2-methylisothiazol，简称MI）的混合物作为一种防腐剂，被广泛应用在淋洗类化妆品中，商品名为卡松。《化妆品安全技术规范》（2015年版）准用防腐剂列表中卡松最大允许使用浓度仅为0.0015%，其中这两种成分的质量比约为m（MCI）：m（MI）=3：1，并常含有少许氯化镁及硝酸镁作为稳定剂。近年来，对化妆品督抽验时，发现部分化妆品防腐剂卡松的添加量在规定限值的上限附近。因此，测量其不确定度对判定产品是否合格影响显得尤为重要。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

L-2000型高效液相色谱仪（带有二极管阵列检测器，日立公司）;

XS105 DU 电子天平（d=0.01 mg，METTLER TOLEDO）;

BECKMAN Avanti J-E型离心机;

AS3120A型超声波清洗仪;

Millipore-Q超纯水器（美国Millipore公司）;

PHS-3C酸度计（上海精科）。

1.1.2 试剂

甲基氯异噻唑啉酮：纯度98.4%（德国Dr.Ehrenstorfer GmbH）;甲醇，色谱纯;磷酸氢二钠，优级纯;乙腈，色谱纯;氯化十六烷基三甲胺，优级纯;0.45 μm微孔滤膜（美国Millipore公司）

1.2 环境条件

温度：（20±5） ℃，相对湿度：≤70%。

1.3 实验方法

样品中的甲基氯异噻唑啉酮组分经甲醇提取，用高效液相色谱仪分析，以标准曲线法计算含量。

1.3.1 样品处理

称取样品1 g（精确到0.0001 g）至具塞比色管中，加甲醇至10 mL，振摇，超声提取15 min，离心，经0.45 μm滤膜过滤，滤液作为待测溶液，供液相色谱测定，进样量5 μL。

1.3.2 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX C18柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）;流动相：0.05 mol/L磷酸二氢钠+甲醇+乙腈（50+35+15），加氯化十六烷基三甲胺至最终浓度为0.002 mol/L，并用磷酸调pH至3.5;流速：1.0mL/min;检测波长：280 nm;柱温：30 ℃。

2 结果与分析

2.1 数学模型

样品中甲基氯异噻唑啉酮含量的计算公式为：

[ω=C×V×10-4m×100%] （1）

式中：[ω]——样品中甲基氯异噻唑啉酮含量，%;

C——从标准曲线上得到待测组分的质量浓度，μg/mL;

V——样品定容体积，mL;

m——样品取样量，g。

2.2 测量不确定度的来源

根据甲基氯异噻唑啉酮检测方法，分析不确定度的主要来源有：样品称量引入的不确定度，样品定容引入的不确定度，待测液中甲基氯异噻唑啉酮的浓度引入的不确定度，重复性测量引入的不确定度。

2.3 测量不确定度分量的计算

2.3.1 样品称量引入的不确定度

本方法称样量为1.000 g，测定使用电子分析天平准确至0.1 mg，根据电子分析天平校准证书，在50 g量程范围内，该天平的最大允差是0.2 mg，按均匀分布k=[3]计算则样品称量引起的相对不确定度为：[ur（样m）=0.2k=0.23=0.115 mg]，则样品称量引入的不确定度为：[ur（样m）=0.1151000=0.000115]，其他因素引入的不确定度较小，可以忽略不计。

2.3.2 样品定容体积引入度的不确定度

样品定容，10 mL具塞比色管定容体积引入的不确定度是由量器校准和溶剂与量器校准时的温差引入的。经查JJG 11-1987标准，10 mLA级具塞比色管容量允差为±0.1 mL，取均匀分布，k=[3]，则[ur（样V1）=0.1k×10=0.13×10=0.00577];实验室的温度在20±5 ℃，温度变化引起的不确定度可通过甲醇体积膨胀系数（1.2×10-3 ℃-1）与温度变化来进行计算，取均匀分布k=[3]，不确定度为：[ur（样V2）=0.0012×53=0.00346];样品定容体积引入的相对不确定度是：[ur样V=（u2r样V1+u2r样V2=0.00673]。

2.3.3 待测试样甲基氯异噻唑啉酮浓度引入的不确定度

标准物质纯度引入的不确定度;标准物质称量引入的不确定度;标准曲线配制引入的不确定度;标准曲线拟合引入的不确定度。

2.3.3.1 标准物质纯度引入的不确定度ur（标p）

从标准物质证书查得甲基氯异噻唑啉酮的扩展不确定度，[Ur=0.31%]（k=2），[ur标p=0.00155]。

2.3.3.2 标准物质称量引入的不确定度ur（标m）

标准物质称量采用精度d=0.01 mg的电子天平，称取标准品甲基氯异噻唑啉酮20.74 mg。根据仪器计量检定证书结果，在5 g量程范围内，天平示值误差为0.01 mg，则其区间半峰宽度为0.01 mg，按均匀分布k=[3]计算，则[u（样m）=0.01k=0.013=0.00577] mg。则标准物质称量引入的不确定度[ur（标m）=0.00577/20.74=0.000278]。

2.3.3.3 标准曲线配制引入的不确定度ur（标v）

标准曲线配制引入的不确定度主要来源于量具误差和环境温度。

标准曲线配制过程：准确称取适量甲基氯异噻唑啉酮标准品20.74 mg至50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，混匀，即得甲基氯异噻唑啉酮标准储备溶液;用1 mL移液器吸取甲基氯异噻唑啉酮标准储备溶液1 mL至50 mL容量瓶中，用甲醇定容混匀，得甲基氯异噻唑啉酮标准使用溶液。用1 mL移液器分别吸取甲基氯异噻唑啉酮标准使用溶液0.5 mL、1 mL，用5 mL移液器分别吸取甲基氯异噻唑啉酮标准使用溶液2 mL、4 mL、5 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇定容混匀，得系列浓度标准溶液。

经查甲醇体积膨胀系数为1.20×10-3 ℃-1，根据移液器和常用玻璃量器检定规程规定的最大允许误差，按照下面公式计算其相对标准不确定度。

[ur（V校準）=a校准k×V] （2）

[ur（V温度）=a温度k×V] （3）

式中：[a校准]——量具校准引起的体积偏差;

[a温度]——温度波动引起的体积偏差，等于温度波动×体积膨胀系数×使用体积;

K——[3]（按均匀分布计算）;

V——标准溶液体积。

标准曲线配制引入的不确定度见表1。

标准曲线配制引入相对标准不确定度为：

[ur标V=0.003652×5+0.003512×2+0.006732+0.006732×2+0.004512+0.004892+0.004892=0.0172]

2.3.3.4 标准曲线拟合引入的不确定度ur（[x]）

对标准系列溶液中的每一个浓度测定2次，得到相应的响应值，用最小二乘法拟合，拟合结果见表2。

[u（x）=Syb1p+1m+（x-c0）2i=1n（ci-c0）2] （4）

[SXX=i=1n（ci-c0）2] （5）

[Sy=i=1n[yi-（α+bci）]2n-2] （6）

式中：S[y]——峰面积的剩余标准偏差;

[yi]——各个标准溶液浓度对应的仪器响应值;

[α]——校准曲线的截距;

b——校准曲线的斜率;

m——曲线点数，每个点测量2遍，m=2×5=10;

ci——校准曲线系列标准工作溶液的浓度。

校准曲线拟合的相对标准不确定度为：

[u（x）=Syb1p+1m+（x-c0）2i=1n（ci-c0）2=847.54477612+110+0.991-1.22421.667=0.0120]

其中，m=n×重复次数（n为标准系列点数5，重复次数2次）;p为待测样品的重复测定次数，p=2;[c0]为标准系列各点浓度的平均值=1.224 μg/mL;[x]为待测样品浓度的平均值（0.991 μg/mL），由式（6）计算得[Sy=847.5]，由式（4）计算得标准曲线拟合引入的标准不确定度为[u（x）=0.0120]，由标准曲线拟合引入的相对标准不确定度为：[ur（x）0.0120/0.991=0.0121]。

2.3.4 液相色谱仪引入的不确定度u（仪）

由高效液相色谱仪校准证书查得：定量测量重复性RSD=0.60%，则相对扩展不确定度为0.60%，按均匀分布计算[k=3]，[ur（仪）=0.0063=0.00346]。

2.3.5 重复性引入的相对标准不确定度

将同一样品重复测定6次，得到相应的峰面积及浓度，数据见表3。

应用标准偏差公式[sc=i=1nci-c2n-1]计算，[sc=0.00179]。

则被测样品引入的相对标准不确定度为：[ur（样ω）=Scx=0.001790.990=0.00181]。

2.4 相对标准不确定度的合成

测量模型中输入量估计值相互独立，将各项不确定度的分量进行合成，合成标准不确定度为：

[ur（ω）=u2r样m+u2r样v+u2r标p+u2r标m+u2r标v+u2rlx+u2r仪+u2r样ω=]

[0.0001152+0.006732+0.001552+0.0002782+0.01722+0.01212+0.003462+0.001812=0.0225]

2.5 扩展不确定度

该测量误差分布属正态分布，在95%置信水平，包含因子k=2，则甲基氯异噻唑啉酮的扩展不确定度[Ur（ω）=k×ur（ω）=2×0.0225=0.0450]，[U（ω）=ωUr（ω）= 0.000991%×0.0450= 0.000045%]。

2.6 甲基氯异噻唑啉酮检验结果

甲基氯异噻唑啉酮含量为：0.000991%±0.000045%，k=2。

3 结语

由以上评定结果可知，标准曲线配制和标准曲线拟合对检测结果影响最大。用高效液相色谱法测定化妆品中甲基氯异噻唑啉酮含量，当样品中甲基氯异噻唑啉酮为0.000991%时，扩展不确定度为0.000045%。根据《化妆品安全技术规范》（2015年版）化妆品准用防腐剂（表4）规定，甲基氯异噻唑啉酮和甲基异噻唑啉酮与氯化镁及硝酸镁的混合物（甲基氯异噻唑啉酮：甲基异噻唑啉酮为3∶1）最大允许添加浓度为0.0015%，计算甲基氯异噻唑啉酮最大允许添加浓度仅为0.001125%。

【参考文献】

[1]    庄艺协，吴思敏.高效液相色谱法测定化妆品中苯甲醇的不确定评估[J].广东化工，2017（10）：215-216.

[2]    苏哲，林庆斌，王钢力，等.化妆品防腐剂甲基异噻唑啉酮的安全风险评估及技术法规要求最新进展[J].香料香精化妆品，2019（1）：78-82.

[3]    化妆品安全技术规范[S].

[4]    测量不确定度评定与表示：JJF 1059.1-2012[S].

[5]    常用玻璃量器：JJG 196-2006[S].

[6]    移液器：JJG 646-2006[S].

[7]    專用玻璃量器：JJG 10-2005[S].

【作者简介】

程红新（1966-），女，高级工程师，学士，研究方向为食品化妆品检测，手机号码：13252821380，E-mail：sychx66@163.com。

陆军（1968-），女，教授级高级工程师，学士，研究方向为食品化妆品检测。