ICAM-1在大鼠心肌纤维化模型中的表达作用研究

蒋书美，施鹏，王立超，王璨，石开虎

（安徽医科大学第二附属医院 心胸外科，安徽 合肥 230601）

0 引言

多种心血管疾病的中晚期阶段主要发生心脏重塑，心肌纤维化是心脏重构的主要病理特点，例如心肌梗死、房颤等[1]。因此对心肌纤维化发生机制的研究具有重要的临床价值。心肌组织中细胞外间质（ECM）成分生成增加是心肌纤维化主要的病理特征，ECM主要以I型胶原分子（Collagen I）为主[2]。现已清楚心肌纤维化的机制是心脏成纤维细胞（CFs）的激活，进而转化为肌成纤维细胞，导致α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和Collagen I等合成增加[3]。

细胞间黏附分子-1（ICAM-1），又叫CD54，属于黏附分子中免疫球蛋白超家族中的成员[4]。主要功能是介导细胞与其他细胞或细胞外基质组分的结合和相互作用；研究已证明ICAM-1参与细胞的信号转导与活化、细胞组织生长及分化、免疫应答、炎症反应、血管生成及肿瘤转移等多种生理病理过程[5]。近年来ICAM-1在心脏疾病中的研究也越来越多。本实验将用异丙肾上腺素（ISO）增加大鼠心脏后负荷构建心肌纤维化动物模型，通过检测动物模型组中ICAM-1的表达变化，来研究ICAM-1在心肌纤维化过程中的可能作用，为其更深入的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料

1.1.1 实验动物：SD雄性大鼠40只，体重（40±2）g。购于安徽医科大学实验动物中心，动物许可证号：SYXK（皖）2018-001。

1.1.2 主要试剂：胰蛋白酶（加拿大WISENT公司），蛋白酶抑制剂PMSF、细胞组织裂解液RIPA（上海Beyotime公司），Western-Blot相关蛋白分子的一抗、二抗（万类生物科技公司），ICAM-1及相关胶原分子引物（上海普迪生物技术公司）。

1.1.3 主要仪器：电泳仪、显影机等相关Western-Blot设备（上海Tanon公司），酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司），显微镜（日本Olympus公司），PCR扩增仪、逆转录仪（美国Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 心肌纤维化动物模型的建立：取SD大鼠40只，平均分为ISO模型组和对照组。ISO模型组小鼠皮下注射异丙肾上腺素5 mg/kg，2周。对照组皮下注射等量生理盐水，2周。实验后处死大鼠，取心脏组织标本。

1.2.2 Western-Blot法检测ICAM-1等相关分子蛋白的表达：用配制好的混合裂解液提取组织总蛋白。加样后分别予以80 V，30 min后改120 v电泳1 h左右。接着设定恒流200 mA进行转膜。然后将膜放入TBST配制的5%脱脂牛奶，摇床慢摇封闭1.5 h。最后孵育一抗和二抗。显影：吸取等量ThermoECL发光A液和B液放入EP管中混匀，将其滴入PVDF膜的蛋白面上，进行显影拍照，选择曝光时间，保存图片。

1.2.3 qRT-PCR法检测ICAM-1等相关分子mRNA的表达：用预冷的TRIzol溶液提取组织的总RNA，提取的RNA加入DEPC水吹匀后测浓度跟纯度确保260 nm/280 nmOD值在1.8~2.0之间。将总RNA逆转录成cDNA，目标cDNA的扩增（qRT-PCR）：在超净工作台，八联管中每孔加入cDNA样本1.6 uL，被扩增基因的引物3.2 uL，然后在避光的环境下每孔加入5.2 uL的TbGreen至总反应体系总量为10 uL。将八连管放入PCR机子中，进行目标基因扩增。以β-actin为内参，用2-ΔΔCT法计算各组目标mRNA的表达量。

1.3 统计学处理。采取SPSS 20.0软件进行数据分析，结果以均数±标准差（±s）表示，单因素变量两组之间用t检验，P<0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠心肌纤维化模型心脏病理学改变。大鼠心脏组织切片HE、Masson染色所示：较对照组比，ISO模型组大鼠心肌细胞排列紊乱，体积明显增大，形态不规整，细胞间质胶原纤维明显增多，排列紊乱，见图1。

图1 大鼠心肌组织的HE、Masson染色图×400

2.2 ISO模型组心肌组织ICAM-1分子蛋白的表达。Western-Blot法检测结果所示：ISO模型组大鼠心肌组织中α-SMA、Collgen I和ICAM-1分子蛋白表达都较对照组明显增加，差异有统计学意义（P<0.05），见图2。

图2 大鼠心肌组织中目的分子的蛋白表达变化

2.3 ISO模型组心肌组织ICAM-1分子mRNA的表达。qRT-PCR法检测结果所示：ISO模型组大鼠心肌组织中α-SMA、Collgen I和ICAM-1分子mRNA的表达量都较对照组明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

心肌纤维化现被广泛认为是众多心血管疾病的终末病理表现，主要有修复替代性纤维化和间质代偿性纤维化两种形式，其都涉及到CFs的激活。心肌发生纤维化的标志是α-SMA和Collagen I的合成增加，最终导致ECM增多出现心肌肥厚、心肌收缩力降低等。ICAM-1参与众多的生理病理过程，例如Harjunpää H等人报道过其在免疫反应和肿瘤微环境中的作用，还描述了恶性肿瘤细[6]胞如何利用细胞粘附分子来促进肿瘤的生长和转移。同时Fernandez IE等人研究发现可溶性ICAM-1在肺纤维化小鼠外周血中升高，且与纤维化程度密切相关，组织结合性ICAM-1在肺匀浆中也升高。但其在心肌纤维化中的作用研究较少。

本实验发现大鼠ISO模型实验组的心肌组织发生了病理性的纤维化肥厚并检测到Collagen I和α-SMA在蛋白和mRNA水平上表达增加，说明构造心肌纤维化动物模型成功。与此同时我们发现较对照组相比，在ISO模型组中ICAM-1表达是升高的，其结果与Samir Bolívar等人研究报道是一致的，说明ICAM-1参与促进了心肌纤维化的发生过程。但本实验只是从体内动物水平上的初步验证，ICAM-1在心肌纤维化的具体调控通路机制还有待于在细胞水平上的深入研究。