舒尼替尼通过调控lncRNA ROR/miR-670-3p/MARCH5轴对胃癌细胞增殖和凋亡的影响*

陈校力，肖美华，江旭林，汤 俊，李志红，罗庆伟

（湖北省鄂州市中心医院胃肠外科，鄂州 436000）

胃癌是常见的消化系统恶性肿瘤，其发病隐匿，多数患者确诊时已处于中晚期，患者预后较差[1]。近年来，多靶点抗癌药物的研发是新型肿瘤治疗药物研发的焦点。舒尼替尼是一类口服的小分子多靶点受体酪氨酸激酶抑制剂，可抑制肿瘤血管生成，发挥抗肿瘤作用。研究显示，舒尼替尼可在体外抑制胃癌细胞的增殖并诱导细胞凋亡[2]，且其临床治疗转移性胃癌的效果较佳，安全性高[3]。但目前舒尼替尼影响胃癌发生发展的作用机制尚未明确。长链非编码RNA（lncRNA）与微小RNA（miRNA）是两类与肿瘤发生发展密切相关的小分子非编码RNA，lncRNA 作为竞争性内源性RNA 与miRNA 靶向结合，共同影响疾病发展进程[4]。研究显示，胃癌组织中lncRNA ROR表达升高，其高表达的患者预后不良，下调其表达可促进阿霉素和长春新碱诱导的耐药胃癌细胞凋亡[5]。生物信息学软件预测显示，lncRNA-重编码调控因子（ROR）可能竞争性结合miR-670-3p，泛素E3连接酶膜相关锌指蛋白5（MARCH5）可能是miR-670-3p的靶基因。研究显示，miR-670-3p 在肝癌中表达下调，上调其表达可抑制肝癌细胞增殖和侵袭[6]；MARCH5 在乳腺癌细胞中表达上调，其通过诱导细胞上皮—间质转化促进乳腺癌细胞的生长和转移[7]。但miR-670-3p/MARCH5 对胃癌细胞恶性生物学行为的影响还未知。因此，本研究以lncRNA ROR/miR-670-3p/MARCH5轴为切入点，探讨舒尼替尼影响胃癌细胞增殖和凋亡的分子机制。

1 材料与方法

1.1 细胞和实验试剂 胃癌细胞系GC9811-P由中国科学院上海细胞库提供；胎牛血清（FBS）购自浙江天杭生物科技公司；细胞计数试剂盒-8（CCK-8）、RIPA试剂、二喹啉甲酸（BCA）蛋白检测试剂盒、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒和RPMI 1640培养基均购自北京索莱宝公司；Trizol 试剂和LipofectamineTM2000试剂盒购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒和PCR试剂盒购于大连宝生物；双荧光素酶活性检测试剂盒购自美国Promega 公司；细胞周期蛋白D1（CyclinD1）购自美国Santa Cruz 公司；活化半胱天冬酶-3（Cleaved-caspase-3）和MARCH5抗体购自Abcam 公司；PCR 引物、miR-670-3p 模拟物（mimics）及模拟对照序列（miR-NC）、miR-670-3p抑制剂（anti-miR-670-3p）及抑制剂阴性对照序列（anti-miR-NC）、lncRNA ROR小干扰RNA（si-ROR）、MARCH5小干扰RNA（si-MARCH5）及小干扰RNA 阴性对照（si-NC）、lncRNA ROR 过表达载体（pcDNA-ROR）、MARCH5 过表达载体（pcDNAMARCH5）和空载体（pcDNA-NC）均由上海吉凯基因公司提供。

1.2 细胞培养和转染 用含10 % FBS 的RPMI 1640 培养基培养GC9811-P 细胞。取对数期GC9811-P细胞接种于6孔板中（1×105个/孔），用LipofectamineTM2000 脂质体法，分别转染miR-670-3p mimics、anti-miR-670-3p、miR-NC、anti-miR-NC、si-ROR、si-MARCH5、si-NC、pcDNA-ROR、pcDNAMARCH5、pcDNA-NC，转染时间6 h。

1.3 细胞分组与处理 未转染的GC9811-P细胞分为对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，对照组用常规培养基培养24 h，低、中和高剂量组分别用含0.06 μmol/L、0.30 μmol/L 和1.50 μmol/L[2]舒尼替尼的培养基培养24 h。转染si-ROR、si-NC、miR-670-3p mimics、miR-NC和si-MARCH5的细胞分别记为si-ROR 组、si-NC 组、miR-670-3p 组、miR-NC 组和si-MARCH5 组。转染pcDNA-MARCH5 和pcDNANC的细胞均用含1.50 μmol/L舒尼替尼的培养基培养24 h，并分别记为舒尼替尼+pcDNA-MARCH5组和舒尼替尼+pcDNA-NC组。

1.4 CCK-8 法检测细胞活力 细胞接种于96 孔板中（0.5×103个/孔），按照分组处理细胞，每组设置3个复孔。培养结束后，加10 μL CCK-8工作液，再孵育4 h，用酶标仪检测450 nm 波长处的吸光度（A）值。A值越高，细胞活力越高。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 细胞接种于24孔板中（2.5×104/孔），按照分组处理细胞，每组设置3 个复孔。培养后，0.25 %胰蛋白酶消化，收集细胞，PBS 清洗2 次。参照Annexin V-FITC/PI 试剂盒说明书，用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.6 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测细胞lncRNA ROR、miR-670-3p 和MARCH5 表达 Trizol试剂提取细胞中总RNA，逆转录为cDNA，行PCR扩增。引物序列：lncRNA ROR 正向引物：5’-CCTGTCCTCCTGCTCTTTGC-3’，反向：5’-TTTCTTGGGCTGGTTGGTCT-3’；miR-670-3p 正向引物：5’-CTGATCGTGAGGAGAGTGT-3’，反向：5’-GGTCTTCGACATCGGGGCGG-3’；MARCH5 正向引物：5’-AAAATGGGGCCTCTGGTG TA-3’，反向：5’-TGACGGGAATGGTGGGTAAA-3’；β-actin正向引物：5’-ACCTGACCGA CTACCTCATG-3’，反向：5’-CTCGTAGCTCTTCTCCAGGG-3’；U6 正向引物：5’-GACAGA TTCGGTCTGTGGCAC-3’，反向：5’-GATTACCCGTCGGCCATCGATC-3’。lncRNA ROR 和MARCH5 以β-actin 为内参，miR-670-3p 以U6 为内参，2－△△Ct法计算lncRNA ROR、miR-670-3p和MARCH5 mRNA相对表达量。

1.7 Western blotting 法检测细胞中MARCH5、CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白表达 RIPA试剂提取细胞中总蛋白，BCA 法对蛋白进行定量，行10%SDS-PAGE电泳。将分离蛋白转至PVDF膜，于5%脱脂奶粉中封闭2 h；一抗MARCH5（1∶1 000）、CyclinD1（1∶800）、Cleaved-caspase-3（1∶1 000）和β-actin（1∶1 000）4 ℃孵育24 h，洗膜；二抗（1∶5 000）室温孵育1 h，洗膜。ECL 显色，成像系统显影、曝光、拍照。Image J 软件分析蛋白条带灰度值。以目的蛋白条带灰度值与内参蛋白条带灰度值的比值为目的蛋白表达量。

1.8 lncRNA ROR 与miR-670-3p 及miR-670-3p 与MARCH5靶向关系验证 LncBase Predicted v.2 和starbase 生物信息学软件预测显示，lncRNA ROR 与miR-670-3p 的核苷酸序列存在连续互补的位点，miR-670-3p 与MARCH5 的3’非翻译区（3’UTR）存在连续互补的位点。PCR 分别扩增分别含miR-670-3p 结合位点的lncRNA ROR 与MARCH5 3’UTR序列，构建lncRNA ROR与MARCH5的野生型荧光素酶报告质粒WT-lncRNA ROR 和WTMARCH5。同时，利用基因突变技术将结合位点突变后分别构建lncRNA ROR 与MARCH5 的突变型荧光素酶报告质粒MUT-lncRNA ROR 和MUTMARCH5。分别将WT-lncRNA ROR、MUT-lncRNA ROR、WT-MARCH5、MUT-MARCH5 与miR-670-3p mimics、miR-NC 共转染至GC9811-P 细胞。转染6 h后，检测各组细胞的荧光素酶活性。

1.9 统计学方法 采用SPSS 22.0软件分析实验数据。计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较用单因素方差分析，进一步两两比较用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 舒尼替尼对GC9811-P 细胞增殖和凋亡的影响 与NC 组比较，不同剂量舒尼替尼组GC9811-P细胞活力和CyclinD1 蛋白表达量降低（P＜0.05），GC9811-P 细胞凋亡率和Cleaved-caspase-3 蛋白表达量升高（P＜0.05），见图1。

图1 舒尼替尼对GC9811-P细胞增殖和凋亡的影响

2.2 舒尼替尼对GC9811-P 细胞中lncRNA ROR、miR-670-3p 和MARCH5 表达的影响 与NC 组比较，舒尼替尼组GC9811-P 细胞中lncRNA ROR、MARCH5mRNA 和蛋白的表达水平均显著降低（P＜0.05），miR-670-3p 表达水平显著升高（P＜0.05），见图2。

图2 舒尼替尼对GC9811-P细胞中lncRNA ROR、miR-670-3p和MARCH5表达的影响

2.3 下调lncRNA ROR 表达对GC9811-P 细胞增殖和凋亡的影响 与si-NC 组比较，si-ROR 组GC9811-P细胞中lncRNA ROR表达水平、细胞活力和CyclinD1 蛋白水平降低（P＜0.05），凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平升高（P＜0.05），见图3。

图3 下调lncRNA ROR表达对GC9811-P细胞增殖和凋亡的影响

2.4 上调miR-670-3p表达对GC9811-P细胞增殖和凋亡的影响 与miR-NC 组比较，miR-670-3p 组GC9811-P 细胞的OD450nm和CyclinD1 蛋白水平降低（P＜0.05），细胞中miR-670-3p 水平、凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平升高（P＜0.05），见图4。

图4 上调miR-670-3p表达对GC9811-P细胞增殖和凋亡的影响

2.5 下调MARCH5 对GC9811-P 细胞增殖和凋亡的影响 与si-NC组比较，si-MARCH5组GC9811-P细胞中MARCH5 水平、细胞活力及CyclinD1 蛋白水平降低（P＜0.05），细胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平升高（P＜0.05），见图5。

图5 下调MARCH表达对GC9811-P细胞增殖和凋亡的影响

2.6 lncRNA ROR 与miR-670-3p 及miR-670-3p 与MARCH5靶向关系验 LncBase Predicted v.2 在线软件预测显示，lncRNA ROR 与miR-670-3p 的核苷酸序列存在连续结合位点；starbase在线软件预测显示，miR-670-3p 与MARCH5 的3’UTR 存在连续的结合位点。共转染miR-670-3p mimics 与WT-lncRNA ROR 或WT-MARCH5 的细胞荧光素酶活性均低于共转染miR-NC 与WT-lncRNA ROR 或WTMARCH5 的细胞（P＜0.05），而共转染miR-670-3p mimics 与MUT-lncRNA ROR 或MUT-MARCH5 的细胞荧光素酶活性与共转染miR-NC 与MUT-lncRNA ROR或MUT-MARCH5的细胞荧光素酶活性比较差异均不显著（P＞0.05）。si-ROR 组GC9811-P细胞中miR-670-3p表达水平显著高于si-NC组（P＜0.05），pcDNA-ROR组GC9811-P细胞中miR-670-3p表达水平显著低于pcDNA-NC 组（P＜0.05）。miR-670-3p组GC9811-P细胞中MARCH5蛋白表达水平显著低于miR-NC 组（P＜0.05），anti-miR-670-3p 组GC9811-P细胞中MARCH5蛋白表达水平显著高于anti-miR-NC组（P＜0.05），见图6。

图6 lncRNA ROR与miR-670-3p及miR-670-3p与MARCH5靶向关系验证

2.7 上调MARCH5 降低舒尼替尼对GC9811-P 细胞增殖和凋亡的影响 与舒尼替尼+pcDNA-NC 组比较，舒尼替尼+pcDNA-MARCH5 组GC9811-P 细胞活力和CyclinD1 蛋白水平升高（P＜0.05），凋亡率和Cleaved-caspase-3 蛋白水平降低（P＜0.05），见图7。

图7 上调MARCH5降低舒尼替尼对GC9811-P细胞增殖和凋亡的影响

3 讨论

舒尼替尼是一类新型的吲哚类多靶点酪氨酸激酶抑制剂，已被用于治疗晚期肾癌及对伊马替尼抵抗的胃肠道间质瘤[8]。此外，舒尼替尼在乳腺癌、非小细胞肺癌等肿瘤中表现出明显的抗肿瘤作用[9-10]。本研究结果显示，舒尼替尼可降低胃癌GC9811-P细胞的增殖能力且加剧GC9811-P细胞凋亡，这提示其可能具有抗胃癌的作用。CyclinD1是细胞周期相关蛋白，调节细胞通过G1/S 期检查点，其表达增加可促进细胞增殖[11]。Caspase-3 是caspase 级联反应的关键调控分子，其活化后剪切下游分子，进而诱导细胞凋亡[12]。本研究显示，舒尼替尼作用抑制胃癌GC9811-P 细胞中CyclinD1 蛋白表达，而促进Cleaved-caspase-3蛋白表达，进一步从蛋白水平说明舒尼替尼可抑制胃癌细胞增殖，并促进细胞凋亡，具有一定抗胃癌作用。

lncRNA 在真核生物中广泛存在，参与调控细胞的增殖、凋亡和侵袭等生命过程[13]。研究显示，lncRNA ROR 在结直肠癌细胞中呈高表达，其可竞争性结合miR-223-3p，增强了结直肠癌细胞的增殖和侵袭能力；LncRNA ROR通过促进Notch1蛋白表达促进子宫内膜癌细胞增殖，并阻碍细胞凋亡；LncRNA-ROR 在卵巢癌组织中的表达明显高于正常卵巢组织，且其高表达与患者临床分期和分化程度呈正相关，过表达lncRNA ROR 通过靶向miR-145上调FLNB表达促进卵巢癌细胞迁移、侵袭及上皮-间质转化[14-16]。本研究结果显示，下调lncRNA ROR表达可抑制GC9811-P 细胞增殖并诱导其凋亡，这提示lncRNA ROR 在胃癌的发展中起促癌基因作用，其有可能成为胃癌治疗的分子靶点；此外，舒尼替尼对胃癌GC9811-P 细胞中lncRNA ROR 表达起抑制作用，进一步提示舒尼替尼可能通过下调lncRNA ROR表达发挥抗胃癌作用。

LncBase Predicted v.2 生物信息学软件预测显示，lncRNA ROR 与miR-670-3p 的核苷酸序列存在连续互补位点，这提示lncRNA ROR 可能靶向结合miR-670-3p，本研究利用双荧光素酶报告基因实验证实了这一结果。同时，上调GC9811-P 细胞中lncRNA ROR的表达抑制了miR-670-3p表达，而下调lncRNA ROR 表达则促进了miR-670-3p 的表达，进一步说明lncRNA ROR靶向结合并负调控miR-670-3p 表达，这也与舒尼替尼抑制胃癌GC9811-P 细胞中lncRNA ROR 表达而促进miR-670-3p 表达的结果一致。研究显示，靶向抑制miR-670-3p的表达可促进肺腺癌细胞增殖和迁移，miR-670-3p作为抑癌基因参与肺癌发展进程[17]。本研究显示，上调miR-670-3p 表达可抑制胃癌GC9811-P 细胞增殖，并促进细胞凋亡，提示miR-670-3p有可能成为抑制胃癌发生发展的分子靶点。

MARCH5 是一种线粒体外膜蛋白，属于MARCH 家族成员。Starbase 生物信息学软件预测显示，miR-670-3p与MARCH5的核苷酸序列存在连续互补的位点，这提示MARCH5可能是miR-670-3p的靶基因。本研究利用双荧光素酶报告基因实验证实了MARCH5 是miR-670-3p 的靶基因，且上调miR-670-3p表达抑制GC9811-P细胞中MARCH5蛋白表达，而下调miR-670-3p 则促进MARCH5 蛋白表达。研究显示，MARCH5 在宫颈癌、鼻咽癌和卵巢癌等肿瘤中表法上调，下调MARCH5降低了肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力[18-20]。但目前，MARCH5对胃癌细胞恶性生物学行为的影响还未知。本研究结果显示，下调MARCH5 对胃癌GC9811-P 细胞增殖起抑制作用，而对其凋亡起促进作用，这提示通过采用一定措施降低MARCH5 表达有可能抑制胃癌的发展进程。本研究还结果显示，舒尼替尼可抑制胃癌GC9811-P 细胞中MARCH5 表达，而上调MARCH5表达逆转了舒尼替尼对GC9811-P细胞增殖和凋亡的影响，提示舒尼替尼通过下调细胞中MARCH5表达抑制GC9811-P细胞增殖及诱导其凋亡。

综上所述，舒尼替尼可有效抑制胃癌细胞增殖并诱导细胞凋亡，其作用机制与调控lncRNA ROR/miR-670-3p/MARCH5轴有关。