广西地区食管鳞状细胞癌热点基因突变谱分析*

王守峰，吴俊伟，苏刘福，叶甲舟

（广西壮族自治区肿瘤医院，南宁 530021）

食管癌（sophageal cancer，EC）在全球所有类型的癌症中的发病率为第7 位，患者的存活率低。在中国，食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）占EC 患者的95%以上。由于对于ESCC 的早期检测没有敏感的方法，所以被诊断时，大部分EC患者已经处于疾病晚期，且这些患者在诊断时有超过一半发生了癌细胞转移。因此，对于早期ESCC的预测和治疗非常重要[1]。然而，目前暂无有效的治疗方法，放、化疗是唯一的治疗选择。肿瘤靶向药物是近年来治疗的主要趋势，通过选择性作用突变蛋白或基因，有针对性地抑制癌细胞，几乎不影响正常细胞，具有“高效低毒”的特点。然而，靶向药的应用前提需要明确患者具体突变类型，以判断患者能否从中获益。同时，由于缺少肿瘤中基因突变的具体信息，针对某类肿瘤药物的靶向药物开发也会陷入困扰[2]。高通量测序能够同时检测多个基因多位点突变，融合基因，基因拷贝数变化，基因缺失/扩增等功能，已逐渐被运用在指导晚期癌症的用药中[3]。研究表明，针对患者具体的靶点选择合适的新辅助化疗手段，已被证明可提高对卵巢癌[4]、HER2 阳性乳腺癌[5]等的治疗效果。本研究将利用高通量测序分析ESCC样本的热点基因突变情况，分析主要突变位点、突变类型和频率，为寻找ESCC 的生物标志物以及潜在药物作用靶标提供基础。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2020年1～12月就诊于广西壮族自治区肿瘤医院的65例ESCC患者的肿瘤组织，其中女24 例，男41 例，年龄30～75 岁，平均（55.26±8.6）岁，且排除其它肿瘤。本研究经医院医学伦理委员会批准，研究对象签署知情同意书。

1.2 DNA 的提取和文库的准备 使用QIAamp DNA 的FFPE 组织试剂盒（德国Qiagen,Hilden）提取DNA。使用Qubitds DNA HS 检测试剂盒和Qubit 3.0 测度计(Life Technologies,Eugene,Oregon,USA)定量DNA。按照Illumina 标准库建设说明构建顺序库（Illumina，Inc，美国加利福尼亚州）。根据制造商提供的方法，文库构建的最佳DNA 为20 ng（1.67 ng/μL），最小DNA为5 ng（0.41 ng/μL）。每个文库都使用KAPA SYBR®FAST 通用qPCR 工具包进行量化。

1.3 样本分析将样本送至至本医疗科技公司进行溯系列分析（Illumina 高通量测序平台），根据操作流程进行超深度测序（平均测序深度大于500×），共检测638 个癌症相关基因的全部外显子，63 个基因的部分内含子，鉴定不同类型的基因变异，如单核苷酸变异、插入或缺失、拷贝数变异和重排。

1.4 统计学方法 采用GraphPad Prism 8.0 与SPSS 19.0 统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差()表示，多组间比较采用方差分析；计数资料以百分率（%）表示，组间比较采用χ²检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ESCC患者不同年龄段人数统计 通过统计患者年龄、性别和发病率，本研究其中男患者分布：30～39岁，3例；40～49岁，5例；50～59岁，20例；60～69岁，11 例；70-75 岁，2 例。女患者：30～39 岁，1 例；40～49岁，3例；50～59岁，12例；60～69岁，7例；70～75岁，1 例。患者年龄主要集中于50～69 岁，男患者与女患者在此年龄段的比例分别为75.61%和79.17%。

2.2 ESCC高频突变基因 根据检测结果统计突变率（图1），突变率排名前10 的基因分别为TP53（90.77%）、CCND1（53.85%）、FGF19（52.31%）、FGF3（50.77%）、FGF4（50.77%）、CDKN2A（32.31%）、KMT2D（21.54%）、NOTCH1（21.54%）、TP63(20%)、ZNF750（18.46%）、LRP1B（18.46%）。

图1 ESCC中突变率前10的基因及各自的突变率

2.3 不同类型的突变在65例中的分布情况 从本研究的65 个患者基因突变类型（alternation type）分析中可以得出，92.31%（60/65）发生了拷贝数改变（copy number change）。而这60 个发生拷贝数改变（copy number change）的人中，绝大多数，即93.33%（59/60）发生了基因扩增（gene amplification），23.33%（14/60）发生了基因缺失（gene deletion），且以上同时发生了基因扩增和缺失的占23.33%（14/60）。

65例患者都发生了短变体(short variants)，且都伴随着替换(substitution)。53.85%（35/65）发生在chr17（17 号染色体），其次为chr2，52.31%（34/65），chr1，chr9，chr12，chr8，chr3，chr4，chr19 和chr11 的突变率也呈现较为集中的分布。这65例中，83.08%(54/65)发生了截断突变(truncation)，也以chr17上最多，占57.41%(31/54)，但是具体突变的点分布均匀，未见集中改变的碱基位点。除了这2类主要的突变类型，38.46%(25/65)发生了较长片段的插入与缺失（indel，insertion 和deletion 的简称）；30.77%(20/65)发生了重新排列（rearrangement），见图2～图4。

图2 基因突变类型及在样本中的突变分布

图3 发生拷贝数变异的细分类型及分布

图4 ESCC患者不同染色体基因突变分布

2.4 高频突变基因的主要突变类型和位点 TP53的突变与多种癌症有关。针对TP53 突变的患者进行分析发现，59 例发生了该突变的患者中，突变类型（alternation type）皆为短变体(short variants)，主要为截断突变(truncation)（44.07%，26/59）和替换(substitution)（45.76%，27/59），皆位于chr17 染色体。进一步分析发现，这27个替换样本中，40.74%（11/27）发生基因组DNA 变化。基因组DNA 中，碱基被替换成A 是主要变化，而Coding DNA 中的碱基替换成T是主要变化，见表1。

表1 TP53突变位点信息

针对CCND1 的突变进行分析发现，35 个CCND1突变的患者中，其主要是突变类型为拷贝数变化，97.14%（34/35）的该突变的患者发生基因扩增，无突变位点信息。针对FGF3 突变类型进行分析，发现96.76%（32/33）发生了拷贝数改变（基因扩增）。同样分析FGF19，97.06%（33/34）发生了拷贝数改变（基因扩增），FGF4 突变中94.76%（32/33）发生了拷贝数改变（基因扩增）。分析CDK2A突变发现，其主要发生了拷贝数改变（基因扩增），无具体突变位点。

CDKN2A的突变位点分析结果显示，该位点的突变位于chr9 上（表2），突变位点无聚集性。KMT2D 的突变位点分析结果显示，其主要为G/C碱基被替换（表3）。NOTCH1突变信息显示其主要突变为G/C碱基被替换成A/T（表4）。ZNF750突变信息无集中突变类型和位点（表4），LRP1B 突变信息显示主要突变为G/C碱基被替换成A/T（表5）。

表2 CDKN2A突变位点

表3 KMT2D突变信息

表4 NOTCH1突变信息

表5 ZNF750突变信息

2.5 ESCC 靶点预测 将前10 个高突变基因进行STRING分析，结果显示TP53，NOTCH1，CCND1之间存在关联。其中NOTCH1和TP63为表皮细胞调控的关键蛋白（红球），NOTCH1 和FGF4（蓝球）是细胞凋亡过程中的关键蛋白。表明ESCC的发生与NOTCH1/TP63或NOTCH1/FGF4通路相关。见图5。

图5 STRING分析结果

表6 LRP1B突变信息

3 讨论

EC在全世界的发病率呈逐年上升的趋势，且与地理位置及饮食习惯有关，我国46%的EC 死亡可归因于吸烟和酒精摄入，且男女患者的比例接近[6]。近年来，ESCC 的治疗效果一直不尽人意，主要原因与诊断较晚，远处转移，治疗耐药，肿瘤异质性和复发有关。目前ESCC缺乏高效的靶向治疗药物[7]，派姆单抗和尼鲁单抗（pembrolizumab and nivolumab）现在已被批准用于食管鳞癌，但需要更多的数据来了解这些药物如何在非转移性环境中使用。由于整体预后不佳，仍需要新的治疗方法[8]。现有的方法包括癌症疫苗和免疫检查点抑制剂[9]，以及以NRF2 等信号通路为靶标的药物治疗[10]，放射治疗等[11]。但由于地域不同，基因的突变类型往往也存在差异，传统的候选基因法建立在假说之上，需要进行功能验证，且通量低，无法鉴定出未知的变异位点，因此需要更加全面、高通量的测序方法选择靶点。

随着第二代测序技术的发展，关于EC 基因层面的研究也随之深入[12]。其中，Salem 等[13]揭示了225例中国河北地区患者的ESCC突变情况，发现该地区ESCC 患者中最常见的突变基因是TP53（96%）、CCND1（46%）、FGF4（44%）、FGF19（44%）、FGF3（44%）、CDKN2A（31%）、PIK3CA（26%）、NOTCH1（24%）、KMT2D（18%）、FAT1（16%）和LRP1B（16%），FGFR1 在ESCC 中扩增明显更多。并揭示了中国ESCC 患者的潜在预后生物标志物。临床靶基因分析表明，近一半的中国ESCC 患者可能会受益于基因特异性靶标药物的治疗[14]。而Song 等[15]的研究发现，广东省潮汕地区ESCC 患者中TP53、RB1、CDKN2A、PIK3CA、NOTCH1 和NFE2L2 为突变率最高的基因。因此，分析不同地区ESCC 的基因突变差异，并进一步阐明ESCC 的分子机制，对于制定更好的预防和治疗策略是非常有必要的。

分析以上研究不难发现，肿瘤蛋白p53（TP53）是ESCC 中最常见的突变基因。TP53 突变与高危疾病，对常规化疗的耐药性和预后不良有关[16]。p53在ESCC的诊断和治疗中都是一个有价值的分子靶标。本研究发现，ESCC发生的突变类型中TP53突变率最高，表明其在ESCC 的发生过程中发挥重要的作用。这与Gao 等[17]的研究结果一致，即EC 中，TP53 突变占主导，约为93%，其次为CCND1，占33%、CDKN2A 占20%。Kamata 等[18]用不同TP53突变的ESCC细胞株和两种p53靶向药物进行了细胞活力测定，发现两种细胞株的生长抑制存在差异。提示肿瘤对化合物的响应可能取决于TP53 突变类型，但仍有必要进一步研究TP53与其他基因的相互作用，以确定其作为治疗靶点的有效性。

NOTCH是指编码哺乳动物细胞中跨膜受体家族的一组基因，参与胚胎发育和正常细胞的生长调节、凋亡和分化。NOTCH1是Notch家族的成员，与许多与肿瘤发生有关的信号通路紧密相连。在啮齿动物和人类的正常食道中，NOTCH1 高度表达，在正常生理状态下，NOTCH 通路调控食管鳞状上皮的发育，特别是鳞状分化，对于维持鳞状上皮的完整性是必不可少的[19]。暴露于外在和内在因素，如胃食管反流、饮酒和炎症，都会下调NOTCH 通路，从而抑制食管鳞状上皮细胞的鳞状分化。在ESCC中，NOTCH信号通路具有抑癌和致癌的双重作用。可以通过多种方法来实现NOTCH1抑制，其中最常见的方法是产生泛NOTCH抑制作用的分泌酶抑制剂DAPT(GSI-IX)，或者使用产生更特异的阻断作用的NOTCH1短干扰RNA或NOTCH1单克隆抗体。NOTCH1的下调可以单独使用，也可以与化学疗法联合使用，从而达到协同作用并降低耐药发生[20]。最近，Alvarez-Trotta 等[21]发现了一种小分子抑制剂NADI-351，能够选择性地破坏EC 细胞中NOTCH1转录，在小鼠模型中表现出强大的抗肿瘤活性，且不会引起肠道毒性。这为今后的研究提供了一定的参考。

本研究通过蛋白之间相互作用预测发现，NOTCH 突变可能和TP53 存在一定联系。研究表明，突变、缺失和扩增改变了TP53、NOTCH1、CDKN2A和CCND1等基因的正常功能，是促进食管黏膜上皮细胞向ESCC 转化的关键变化，这与本研究非常接近。Zhang等[14]研究中，河北地区ESCC患者的TP53、CCND1、FGF4、FGF19、FGF3、CDKN2A、NOTCH1、KMT2D 和LRP1B（排前10 的突变）也是较高的突变。不同的是，他们的研究中PIK3CA 和FAT1的突变率较高，而本研究中ZNF750和TP63相对较高，而Song 等[15]的研究发现，广东省潮汕地区ESCC患者中TP53、RB1、CDKN2A、PIK3CA、NOTCH1和NFE2L2（排名从高到低）为突变率最高的基因。表明不同区域ESCC 突变存在共性与差异。

对于NOTCH1 相关通路的预测发现，其在ESCC发生发展的过程中存在重要作用。正如Jia等[22]的研究发现，GASC1/NOTCH1 信号通路可能是治疗ESCC 患者的潜在治疗靶点。研究表明，NOTCH1 能够通过促进上皮－间质转化（EMT）和调节细胞周期来加速三阴性乳腺癌，抑制NOTCH1-ATR-CHK1 级联与顺铂协同杀伤TNBC，为这种致命疾病提供了有效的临床选择[23]。基于此，我们可以进一步研究其在ESCC的作用。

之前的研究已经提出了FGF19、FGF4、FGF3和CCND1在各种癌症中的重要作用[13,24-25]。在染色体不稳定的情况下发生的熔断桥循环扩增了CCND1[26]。CCND1 通常与其邻近的致癌基因CTTN 共同扩增，其产物促进ESCC 细胞的迁移[27]。此外，ESCC中的FGFR1、MYC、EGFR、KRAS、MDM2、TP63 和PRKC、SOX2 和PIK3CA、NKX2-1也都已被证实是ESCC 的驱动因素[1]。与之前的研究类似，本研究也观察到CCND1、FGF19、FGF3 和FGF4 的频繁扩增，这支持了ESCC 患者染色体11q13 不稳定的发生。EC 的发病机制涉及一个由多个因素和基因突变积累组成的级联过程。在其它研究中，与ESCC 相关高频突变基因的还包括PTEN、TOP2A、PIK3CA、XRCC1等[28]。

综上，本研究通过高通量测序展示了广西地区ESCC 高频突变基因和位点，提示不同区域之间高频突变基因存在差异，且我们预测NOTCH1 在ESCC 的发生过程中起到重要作用，可以作为进一步研究的方向。此外，本研究结果为基于广西地区ESCC的防治提供指导基础。