尿液S100A6蛋白与细菌／真菌性尿路感染的相关性

蓝子权，曾李婷，肖仪，黄奕桥，张智铭，肖剑，江先汉，彭亮

广州医科大学附属第五医院，广东 广州 510700

尿路感染（urinary tract infection，UTI）是临床最常见的感染性疾病之一，发病率仅次于呼吸道感染［1］，其中尤以细菌或真菌引起的UTI多见。目前临床主要通过结合病史、临床症状及实验室检验结果进行诊断。尿常规分析可作为判断UTI的重要手段，而尿液培养则是确诊UTI的金标准。但尿常规分析存在灵敏度和特异度不高、干扰因素较多的缺点，尿液培养检测速度较慢，不适于大规模筛查。因此，开发新的UTI检测指标具有重要的临床价值。

S100A6蛋白是钙结合蛋白S100家族的一员，已证实其可与钙离子结合，且可调节细胞分裂周期［2］。有报道表明，S100A6蛋白通过调节细胞骨架的微丝蛋白，参与上皮间质转化过程和细胞运动。目前关于S100A6蛋白的研究主要集中于肿瘤发病机制方面，包括胃肠、肝胆、乳腺、子宫、卵巢、骨及泌尿系肿瘤等［3-8］。S100A6蛋白在一些非感染性炎症和自身免疫病的血清中升高［9-10］，但其与感染性疾病的相关性罕见报道，仅有少量研究提示其与动物病毒感染相关［11-12］。S100A6蛋白可在尿路组织中表达，作用尚未明确，本研究对细菌或真菌性UTI患者尿液中S100A6蛋白的表达情况进行检测，并采用ELISA法及ROC曲线评价该蛋白作为UTI初筛指标的诊断价值。

1 材料与方法

1.1 样本 选取2019年4—12月期间，广州医科大学附属第五医院行尿液培养的UTI患者及来自体检中心的健康人群尿液样本，感染组和正常对照组各110份。感染组患者来自门诊及住院部，具有典型的UTI症状，尿常规检测及尿液培养（细菌或真菌培养）结果均为阳性；正常对照组样本的尿液生化检查及培养结果均为阴性。

1.2 排除标准 所有患者均排除患有良、恶性肿瘤；排除患有心肺疾病；排除患有自身免疫性疾病；排除患有结石病及尿路梗阻等疾病。

1.3 主要试剂 S100A6蛋白ELISA试剂盒（货号：CSBE13089h）购自武汉华美生物科技有限公司；兔抗S100A6单克隆抗体（货号：ab181975）购自美国Abcam公司；HRP标记的兔抗山羊IgG（货号：BA-1060）购自中国武汉博士德生物工程有限公司。

1.4 S100A6蛋白含量的检测 将尿液样本经573×g离心10 min，取上清液，采用S100A6蛋白ELISA试剂盒检测尿液中S100A6蛋白A450值，应用Curve Expert软件绘制标准曲线，并取拟合度最佳的曲线方程，将A450值代入方程，计算尿液中S100A6的蛋白浓度；以尿液S100A6蛋白浓度为自变量，分组作为因变量，应用SPSS16.0软件进行Logistic回归分析，并以1-特异度为横坐标，敏感度为纵坐标，绘制ROC曲线，分析S100A6蛋白在UTI中的诊断价值。

1.5 尿液中S100A6蛋白稳定性的检测 采用Western blot法。随机从两组尿液样本中各取2份，100μL／份，经10%SDS-PAGE分离蛋白后，电转移至PVDF膜，用5%脱脂牛奶于室温封闭1 h；加入兔抗S100A6单克隆抗体（1∶10 000稀释），4℃孵育过夜；PBST洗涤3次，每次10 min，加入HRP标记的羊抗兔IgG（1∶5 000稀释），室温孵育1 h；PBST洗涤3次，每次10 min，DAB法显色，通过Image J测量灰度值，以与正常对照组灰度值均值的比值为相对蛋白含量。选取感染组尿液样本，于室温分别放置2、4、8、10、12、24、48、96 h，各时间点分别取100μL，进行Western blot检测，方法同上，通过Image J测量灰度值，以与室温放置2 h的正常对照组灰度值的比值为各时间点的相对蛋白含量。

1.6 统计学分析 应用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析，计量资料中满足正态分布的以均数±标准差（）表示，组间比较采用T检验或方差分析；呈非正态分布的数据采用中位数（四分位数间距）表示，采用非参数Mann-Whitney检验分析。计数资料以率（%）或构成比（%）表示，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料统计 正常对照组健康人群及感染组患者的平均年龄分别为（55.01±19.97）和（50.68±19.67）岁，差异无统计学意义（t=0.090，P=0.920）；正常对照组及感染组男性分别为56和49人，女性分别为54及61人，两组性别差异无统计学意义（χ2=0.893，P=0.345）。

2.2 S100A6蛋白的含量 感染组及正常对照组的S100A6蛋白浓度分别为39.44～1 153.3和13.61～28.07 pg／mL，中位数分别为128.96和16.77 pg／mL，感染组明显高于正常对照组，且差异有统计学意义（Z=-7.092，P=0.000）。见图1。

图1 ELISA法检测两组尿液样本S100A6蛋白的含量Fig.1 ELISA of S100A6 protein content in urine samples of two groups

2.3 Logistic回归分析结果 以尿液S100A6蛋白浓度为自变量，分组作为因变量得出二元Logistic回归方程为y=-0.971+0.04 x，其中OR值为1.004，P=0.001。表明S100A6蛋白与UTI的相关性较高，即S100A6蛋白对UTI有显著影响。

2.4 S100A6蛋白的R O C曲线 S100A6蛋白浓度的ROC曲线下面积（AUC）=0.862，P=0.000，95%CI：0.799～0.925，约登指数=0.628，S100A6取临界值=23.277 pg／mL，灵敏度为91.2%，特异度为71.6%，诊断阳性率达71.2%，漏诊率8.6%，见图2。

图2 S1006A6蛋白的ROC曲线Fig.2 ROC curve of S1006A6 protein

2.5 尿液中S100A6蛋白的稳定性 感染组尿液样本中S100A6蛋白含量明显高于正常对照组（t=-7.33，P=0.03），见图3和图4。感染组尿液样本室温放置2、4、8、10、12、24、48、96 h时，S100A6蛋白含量差异无统计学意义（F=1.60，P=0.21），见图5和图6。

图3 Western blot法检测尿液样本中S100A6蛋白的水平Fig.3 Western blotting of S100A6 protein level in urine samples

图4 两组尿液样本中S100A6蛋白的含量Fig.4 Urinary S100A6 protein contents in two groups

图5 Western blot法检测尿液在室温放置不同时间后S100A6蛋白的稳定性Fig.5 Western blottingof stability of S100A6 protein content in urine samples after storage at room temperature for various hours

图6 尿液于室温放置不同时间后S100A6蛋白的含量Fig.6 S100A6 protein contents in urine samples after storage at room temperature for various hours

3 讨论

UTI作为一种高发性的感染性疾病，不仅应在治疗上给予最佳的治疗措施，也需要高效、准确、便捷的诊断方法。目前，临床使用最多的UTI诊断辅助方法是尿常规检测及尿液培养。尿常规中亚硝酸盐易受空气等因素影响，出现假阳性结果。另外，许多病原菌由于不含硝酸盐还原酶，在感染时并不会出现亚硝酸盐阳性。白细胞酯酶阳性多是脓尿信号，但一些非感染性炎症也会引起白细胞酯酶升高，如尿路结石、移植排斥反应、非感染性肾炎等。尿液培养仍存在许多不足，如UTI中尿液培养阳性率低（约50%）［13-14］，且培养至少需要2～3 d。正常尿液是无菌的，当定值菌超过一定计数就是细菌尿，细菌尿患者不一定有症状［1］。因此，为避免采集尿液时引起的样本污染或非炎症性的细菌尿，临床采用不同的细菌计数方式来诊断UTI。

KUZNICKI等［15］于1987年在患者腹水的肿瘤细胞中分离并纯化获得S100A6蛋白，其可分布在细胞内的胞质、胞膜和细胞核中，但在人体各组织表达不一，主要分布在人体的成纤维细胞及上皮细胞中。S100A6蛋白结合钙离子来改变分子构象，暴露隐藏的疏水区域，与蛋白配体结合后发挥生物调节作用［16］。S100A6蛋白在多种肿瘤表达升高，与肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移密切相关，具备作为潜在的肿瘤标志物的检测价值。另外，S100A6蛋白与炎症的相关性也是近年的研究热点，WANG等［12］于2012年发现，S100A6蛋白与感染密切相关，可能通过NF-κB调节炎症反应，但尚无足够证据。

本研究取健康者尿液作为正常对照组，与确诊UTI的患者尿液的S100A6蛋白含量进行比较。ELISA法检测结果表明，感染组的尿液中S100A6蛋白含量明显高于正常对照组（P＜0.01）。Logistic回归分析表明，S100A6蛋白与UTI存在相关性，提示S100A6蛋白对UTI有显著影响。ROC曲线显示，AUC=0.862，在0.5～0.9之间，表明诊断准确性高；当约登指数为0.628，S100A6取临界值23.277 pg／mL时，灵敏度为91.2%，特异度为71.6%，此时S100A6蛋白的诊断效能最高。为探讨S100A6蛋白与尿液放置时间的相关性，本实验将感染组样本置室温放置2、4、8、10、12、24、48、96 h，观察比较尿液中S100A6蛋白浓度发生的变化。Western blot检测结果发现，各时间点蛋白含量变化差异无统计学意义（P＞0.05），S100A6蛋白可在尿液中保持稳定的抗原性，表明S100A6蛋白可作为稳定的检测指标。作为一种分泌蛋白，S100A6蛋白相对分子质量为10 500，是酸性小分子，其稳定性源于S100A6翻译后糖基化修饰。糖基化可使S100A6蛋白抵抗消化酶的降解作用，影响多肽的构象，从而增强蛋白质的稳定性［17］。

综上所述，S100A6蛋白在细菌或真菌性感染患者的尿液和健康者尿液的差异表达对UTI有较高的辅助诊断价值，且S100A6蛋白稳定的抗原性有利于减少对尿液的保存时间和温度等条件限制，在样本检测方面有较好优势。本研究为S100A6蛋白在病原菌感染中意义的进一步研究提供了实验依据。