单操作者大鼠腹腔异位心脏移植模型的建立与改良*

曾 顺 刘达兴

(遵义医科大学附属医院心血管外科，遵义 563000)

大鼠腹腔心脏移植模型是目前广泛使用的心脏移植动物模型之一，相比于颈部移植模型更易被接受[1]，主要用于移植免疫、病理、药理等方面的研究。此模型的建立最早于1964年由 Abbott等[2]报道，由Ono等[3]在1969年改进并确立该模型的基本术式，但并没能简化其复杂的操作难度，提高成功率，因此不断有研究人员进行大鼠腹腔同种异体异位心脏移植模型的改良。在本研究中，我们经过不断地尝试，在前人的基础上总结出一系列经验及注意事项，对手术步骤进行改良优化，旨在指导初学者快速掌握手术方法，造模过程更加稳定高效。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：受体为SPF级雄性SD大鼠30只，6～8周龄，体质量 200～ 220 g。供体为雄性Wistar大鼠 30 只，6～8周龄，体质量 200～220 g。由辽宁长生生物技术股份有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK(辽)2015-001。自由进食。术前12 h动物禁食不禁水。实验通过遵义医学院附属医院伦理委员会批准，伦理审查编号：KLLY(A)-2019-080。

1.1.2实验器械：血管弯钳1把、直钳1把、外科剪1把、持针器1把、16 cm角头显微镊1把、16 cm直头显微镊 2把、16 cm弯头显微剪2把、16 cm显微针持1把、4.7 cm血管夹2个、V型腹部撑开器1个、自制大鼠手术固定板 2个、自制冰盒 1个、Leica手术显微镜M220F12、8-0无损伤带线缝合针、4-0缝线、套管针、各型号注射器、无菌棉签、无菌纱布及无菌棉球若干。

1.1.3药品：1%戊巴比妥钠(0.8 g/80 mL生理盐水)上海试剂二厂产品，0.9%氯化钠盐水，4 ℃肝素水(25 U/mL∶12 500 U肝素/500 mL生理盐水)江苏万邦生化医药公司，4 ℃心肌保护液(Del Nido，复方电解质注射液500 mL/20%，甘露醇8.15 mL/25%，硫酸镁注射液4 mL/5%，碳酸氢钠11 mL/10%氯化钾10 mL/2%，利多卡因3.25 mL)，5%葡萄糖注射液。

1.2 手术方法

1.2.1麻醉：使用1 mL注射器缓慢腹腔注射1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)，约1 mL，同时麻醉SD大鼠和 Wistar大鼠，注射后3～5 min即进入麻醉状态。若麻醉状态欠佳，逐量追加0.1 mL戊巴比妥钠。观察大鼠呼吸平稳和四肢松弛后，分别固定于自制手术板上。

1.2.2受体准备：麻醉状态适宜后，大鼠置于操作台上固定，摆好仰卧位，纱布折叠后置入后腰部，抬高腹部，腹部备皮，75%乙醇消毒3次。行腹部正中切口剪开皮肤，6～7 cm，沿腹白线剪开腹膜，用V型拉钩牵引撑开腹壁切口，棉签将肠管推向大鼠左侧，不牵拉出体外，用温生理盐水纱布覆盖隔离肠管，棉签钝性分离显露肾静脉分支以下至髂血管分支以上的下腔静脉及腹主动脉，然后显微镊逐层分离。选取一段约1 cm血管，直接电凝离断侧壁及背侧小静脉分支部分(图1a)，取出拉钩，向腹腔内注入2 mL生理盐水，盐水纱布覆盖术区切口备用。

1.2.3供心摘取：麻醉状态适宜后，将大鼠放置于铺好棉垫的固定板上，呈仰卧位，胸、腹部备皮，75%乙醇消毒3次。相同方式打开腹腔，棉签将肠管推向一侧，显露下腔静脉，向下腔静脉注入肝素水2 mL，使供体肝素化，压迫针孔止血1 min，剪断下腔静脉及腹主动脉放血，剪开膈肌，剪断两侧肋骨，U型切口打开胸腔，用止血钳夹持剑突上翻胸骨，打开心包，4 ℃肝素水浇灌心脏表面保持低温。电凝上腔静脉，将肝素水20 mL沿下腔静脉缓慢注射心脏，心脏由红变为土黄色，银白色网状动脉于心脏表面清晰可见为止，再次用10 mL注射器将Del Nido停跳液沿下腔静脉注射入心脏，可看到心脏跳动减慢直到停跳，剪除胸腺组织及多余脂肪组织，显微直角镊沿心脏横窦穿过4-0缝合线，集束结扎肺静脉，上腔静脉、下腔静脉，钝性分离主动脉及肺动脉间隙，以显微剪剪断升主动脉，供心保留长2～4 mm主动脉。同样方法剪断肺动脉，保留相同长度肺动脉。注意主动脉及肺动脉均有分叉，在分叉以下剪断，避免二次修剪。抽取适量肝素水，用适当长度套管针头，沿供心主动脉、肺动脉断端注入，再次灌洗心脏血管,并观察获取血管管径及长度，结扎线提起供心，直接剪断左右肺门、心脏周围静脉，剪去多余结缔组织，置入4 ℃肝素水中保存。

1.2.4心脏移植：夹闭受体选择段血管的下腔静脉、腹主动脉，先夹闭近心端，后夹闭远心端，清除选取段血管上附着的结缔组织，显微镊轻提起下腔静脉，显微剪破开小口，拭去血液，肝素水冲洗，沿小口位置向上做一口径稍长于供心肺动脉的纵切口，肝素水由切口冲洗干净管腔，不残留血栓，同样方法在腹主动脉稍高于下腔静脉纵切口处，做一长度大小与供心主动脉口径一致的纵切口(图1b)，冰盐水纱布包裹供心后放置在腹主动脉侧，调整供心位置待吻合，吻合时升主动脉、肺动脉断端尽量接近受体腹主动脉、下腔静脉纵切口处，用8-0无损伤缝合线予供心主动脉、受体腹主动脉切口行端侧吻合，首先固定近心端一角(图1c)，后固定远心端作起始线(图1d)，将供心提起翻向下腔静脉一侧，连续缝合外侧壁，4～5针可完成吻合(图1e)，首尾两针尽量靠近固定角，吻合至切口另一角时，供心提起翻向腹主动脉侧，进而改变进针方向缝合主动脉内侧壁，连续缝合内侧壁后在远心端起始线头处结扎，约缝合 4～5针可完成吻合，在最后1针打结前用肝素水充盈血管，排净血管及供心内气体，同时观察有无漏口，打结(图1f)。直接下腔静脉固定远心端作起始线连续缝合内侧壁(图1g)，缝合5～6针(图1h)，近心端转角处，从下腔静脉内侧壁穿入，从外侧壁穿出，连续缝合外侧壁，缝合5～6针。在收紧缝线前冲洗吻合口、排出血管及供心内气体(图1l)，棉球包绕吻合处压迫。开放血管夹，先开放远心端，待供心复跳后揭开棉球，观察有无出血漏口，及时压迫止血或加缝。止血完毕后，腹腔注入2 mL生理盐水，关闭腹腔。

图1 Wistar-SD大鼠腹腔异位心脏移植

1.2.5术后处置及观察：术后大鼠单独饲养于鼠笼中，适当暖风复温，一般术后10～20 min苏醒，苏醒后予5%葡萄糖盐水约5 mL饲养补充液体量，术后自由活动、进食，保持垫料干燥及适宜饲养环境，密切通过触诊了解移植心搏动情况，观察大鼠一般情况、双下肢活动等。手术成功标准为术后供心恢复平稳心率(150～220次/min)，每天通过腹部触诊了解供心跳动情况，视Postson心脏收缩分级为Ⅲ～Ⅳ级，供心跳动72 h以上为手术成功。

2 结果

本研究过程中，完成Wistar-SD大鼠腹腔异位心脏移植 30对，成功 29对，成功率 96.7%。因术中误扎心脏，开放后无法止血死亡1例，总手术时间(59.8 ±10.0)min，其中受体血管显露时间(5.1 ±2.0)min，供心摘取时间(9.9 ±3.0)min，受体血管造口时间(4.1±1.0)min，受体腹主动脉端侧吻合时间 (10.4±4 .0) min，受体下腔静脉端侧吻合时间(8.8±3.0)min，供心缺血时间(24.2 ±5.0)min。开放后止血处理(10.2±5.0)min。升主动脉-腹主动脉平均缝合(12.1±2.0)针，肺动脉-下腔静脉平均缝合(13.7±3.0)针。恢复血供到开始心室纤颤时间(10.2 ±2.0)s，心室纤颤期(30.3 ±5.0)s。在移除血管夹开放血供后，所有大鼠均存在吻合口渗血，按压后大部分可止血，均以转角处渗血为主，失血量0.3～0.5 mL，开放血管后可在下腔静脉处观察血流情况，均通畅情况良好，均在术后恢复血供、心跳(如图2)。大鼠术后10～20 min可苏醒，苏醒后对饮水需求较高，2～3 h后可正常饮食，精神可，5～6 h后行走自如，无截瘫、下肢活动障碍、尿潴留等并发症。每日腹部触诊，移植心收缩有力，Postson心脏收缩分级为Ⅲ～Ⅳ级，72 h以上均可触及心跳(150～220次/min)。

图2 血供开放后心脏

3 讨论

大鼠腹部心脏移植模型由Ono等[3]确立基本术式以来，因大鼠制备饲养较方便，且该模型便于术后方便观察，因此在器官移植基础研究中得到了广泛的应用。但是，难度较大的显微缝合技术和各环节复杂操作成为了阻碍。本研究对该模型手术方式进行了改良，旨在让手术操作更为简便，现分享一些小技巧及注意事项。

3.1 麻醉药物

本研究采用麻醉使用1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射，未出现因麻醉死亡案例。本研究在预实验时，采用七氟烷吸入麻醉，同其他研究报道类似[4]，吸入麻醉易出现窒息等情况，需密切观察大鼠呼吸节律等，不断调整麻醉深度，避免窒息情况的发生，在撤除吸入麻醉后1～2 min大鼠即可恢复清醒，翻身活动。经比较麻醉药物优缺点后，正式实验时采取戊巴比妥钠腹腔注射，较吸入麻醉，腹腔注射麻醉优点为术后一般10～20 min苏醒，起到对动物模型的一定制动作用，术后1～2 h可自由活动，术中可以不用关注呼吸情况，不用调节吸入麻醉深度，若使用吸入麻醉单术者操作可能忽略这一过程，致受体窒息，或因此增加供心缺血时间。本研究使用腹腔注射麻醉尚未发生因麻醉死亡案例，效果安全可靠，如术中出现大鼠躁动，可逐量追加0.1 mL麻醉药，但仍需警惕的是，朱力鸣等[5]报道在预实验中出现因手术操作时间过长，大鼠因麻醉效果死亡情况，同其他研究报道相同，随手术时间的增加，麻醉效果会难以判断，在麻醉后期追加给药时需谨慎。

3.2 术中体位

3.2.1受体体位改进：术中受体仰卧位，腰部垫高，使下腔静脉及腹主动脉抬高，位置更浅表，更容易显露，术中操作空间较大，易于术中操作。

3.2.2供体体位改进：术中供体仰卧位，打开胸腔后，背部可置予20 mL注射器抬高整个胸腔，灌注液及血液沿抬高胸腔向腹腔流动，便于整个术区视野的清晰。

3.3 供受体准备顺序及供受体选择

余春俊等[6]可先完成供体心脏获取，再行受体大鼠腹腔血管的显露准备，但本研究单操作者先显露受体大鼠腹腔血管，未影响受体大鼠生理状况，再获取供心，可适当减少供心缺血时间。在选择供受体方便，SD大鼠腹腔选用血管可见分支血管一般少于2根，Wistar大鼠的可见血管分支一般 3～4支，为减少术中结扎分支时间，故选用SD大鼠为受体，Wistar大鼠为供体。受体血管制备时，本实验采取直接电凝离断分支血管，避免结扎引起血管损伤，结扎不完全等术中渗血影响操作视野等情况，本研究认为直接电凝分支血管对大鼠生存影响较小，能大幅度减少术中时间，且完成实验后大鼠无出现截瘫、活动障碍等情况。

3.4 灌注方法

本研究采取沿下腔静脉灌注，灌注冲洗心脏前，阻断上腔静脉，避免上腔静脉血液的回流，减少了灌注冲洗量，一般仅需肝素水20 mL即可达到灌注满意的效果。灌注标准为可以观察到供心由红润变为土黄色, 心壁冠状动脉各分支无残留血液，均呈银白色，表明灌注完全[7]，也有报道采用经胸主动脉灌注以排除供心血液，但该方法不符合心脏血流生理方向，需更大的冲洗灌注量，该过程可能导致心肌损伤，且胸主动脉较下腔静脉显露困难，经过尝试比较后未予采用[8]。

3.5 集束结扎血管

对于供心周围血管的处理，采用的方法为用一根4-0缝合线经心脏横窦通过主动脉、肺动脉背侧，将心脏背侧上、下腔、肺门静脉，左、右心耳集束结扎[8]。该方法具有简便、快速、防止心耳出血、增加复跳后循环血量等优点，但此处需保证结扎可靠，至少三个手术外科结。本实验开始时行两个外科结，开放血管后出现渗血等情况，可再次钳夹后结扎，未影响心脏跳动频率，行三个手术外科结后保证结扎可靠未再次出现集束结扎血管渗血等情况，且采用集束结扎不影响心脏的复跳及频率。

3.6 供心保存

获取供心时，充分冲洗心脏及冠脉血液，并使用Del Nido液保护心肌，获取供心后置入4 ℃肝素水中保存，因为首先完成受体血管显露，一般只需保存3～4 min即可开始缝合，缝合时同样予冰盐水纱布包裹供心，术中无需反复向供心提供盐水浇灌即可达到心肌的保护效果，减少单术者因此耽误的缝合时间，提高效率及心肌保护[9]。

3.7 受体血管吻合口的准备

目前，研究报道是用冠脉刀片切开受体血管前壁或8-0缝针挑起受体血管前壁后剪除挑起部分[10-11]等方式，于受体血管上做一口径与供心主动脉口径近似的纵切口，此两种方法均有一定损伤对侧血管壁可能，特别对于初学者，损伤受体血管后壁概率大，直接导致模型建立失败，在预实验时采用上述方法时，均出现划破后壁血管情况，正式实验采取显微镊稍提起血管壁，显微剪剪开小口，冲洗血液后，沿小口向上做长度适宜的纵切口，应用此方法未再损伤血管后壁，可靠有效，行下腔静脉纵切口时，应略大于肺动脉口径，腹主动脉纵切口与主动脉口径一致，避免缝合后回流不畅，心脏充血变硬。

3.8 血管缝合

采用显微镜下连续缝合，升主动脉-腹主动脉端侧吻合，因上下两角是缝合后易渗血部位，可先固定两角后，连续缝合，针距1 mm，边距0.5 mm，靠近两角的针距尽量缩小，完成最后1针缝合打结前，需向吻合口注入肝素水，排净血管及供心内气体，同时观察潜在的出血口，及时加缝。下腔静脉-肺动脉端侧吻合时，固定两角会加大缝合的难度，且因静脉壁较薄，反复牵拉可能引起静脉壁的撕裂，只固定一角，针距1 mm，边距1 mm,在近心端转角处1针需连续穿过下腔静脉内侧壁和外侧壁，才能保证再次进针的角度。

综上所述，包括在手术前禁食，减少大鼠肠管膨隆干扰，充分准备各种术中需要使用的器械或药品，适宜的麻醉方式，可有效减少手术耗时。每个手术步骤均可能影响实验最后的结果，此模型需要术者具备一定的显微外科能力，全面掌握手术操作的各个步骤，减少缝合时间，减少供心缺血时间，才能高效地完成模型的建立，保证模型构建的稳定效率。本文总结改进的大鼠腹腔异位心脏移植模型操作方法，有效叙述初学者可能遭遇的困难及雷区，一定程度上简化、降低了手术难度，为移植的研究提供便利。