耐辐射奇球菌急性毒性研究*

许 琴 宋来阳 张 蕾 李佳佳 马 娜 江俊峰 刘爱中 蒲凤萍 邓 培 刘江伟 王 玮

(1. 中国人民解放军新疆军区总医院，新疆特殊环境医学重点实验室，乌鲁木齐 830000)(2. 中国人民解放军陆军第九四八医院，乌苏 833000)(3. 新疆农业大学科学技术学院，乌鲁木齐 830091)(4. 新疆特殊环境微生物重点实验室，新疆农业科学院微生物应用研究所，乌鲁木齐 830091)

耐辐射奇球菌(Deinococcusradiodurans，DR)是1956年由Anderson等[1]在辐射灭菌后仍然变质的肉类罐头中分离出来的一种微小球菌。该菌在培养基上形成红色菌落、不形成芽孢、无致病性、革兰氏染色阳性、严格好氧、菌体形态较大，常形成四聚体。耐辐射奇球菌属异常球菌科(Deinococcaceae)异常球菌属(Deinococcus)，该菌对电离辐射的存活最高剂量约15 kGy，抗性是普通真核生物的100倍，对紫外线、干燥、强氧化剂和某些化学诱变剂显示超乎寻常的抗性[2]。陈立等[3]首次从耐辐射奇球菌代谢产物中分离得到5个化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、腺苷、 L-丙氨酸，前4种代谢产物是核酸及脱氧核酸合成的底物。DR的强抗辐射性，其基本机制是有高效的 DNA 修复系统，体内存在超氧化物酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)等抗氧化保护酶系相关基因的高水平表达[4]。

杨桥等[5]对DR中的类胡萝卜素——Deinoxanthin 进行了大量研究，研究结果表明DR中的类胡萝卜素具有很强的清除活性氧自由基的功能。DR的pprⅠ基因及PprM蛋白能够在细胞或小鼠或体内稳定转染，并发挥抗氧化与抑制肿瘤生长的作用[6-7]。我们推测DR在生命科学研究领域中有着广阔的应用前景。近年来科研人员对其环境修复、基因修复等方面研究较多，动物实验及药理学研究相对较少。据所查文献资料，未见DR活菌及其菌体破碎物相关的急性毒性实验报道，我们就此进行了研究，以期为DR作为肠道益生菌的推广应用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

DR活菌培养物由新疆农业科学院应用微生物研究所提供；SPF级KM小鼠60只，雌雄各半，18～22 g，购自新疆医科大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK(新)2018-0002，实验动物使用许可证号：SYXK(军)2017-0050；全自动生化分析仪BS-180(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)；台式低速离心机TDZ5(湖南赫西仪器装备有限公司)；全自动血细胞分析仪BC-2800vet(深圳迈瑞动物医疗电子股份有限公司)；-80 ℃冰箱(三洋)；超声破碎仪SK3310LHC(上海科导超声仪器有限公司)；SW-CJ-2FD双人单面洁净工作台(苏州苏洁净设备有限公司)；分析天平TP-214(丹佛仪器北京有限公司)；ACS-1.5A型电子计重秤(上海友声衡器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1DR浓度的确定：DR培养至对数生长期后，测定其OD值，OD值达到1.9～2.0，细菌增殖基本停止，根据其生长曲线，此时的DR菌液浓度为1×109/mL。将此作为高浓度灌胃菌液，高浓度DR菌液用空白培养基稀释100倍后(1×107/mL)作为低浓度灌胃菌液。

1.2.2DR破碎物的制备：分别将高、低浓度的活菌于-80 ℃冰箱及超声破碎仪中(37 ℃、50 kHz、30 min)反复冻融5～7次，得到高、低浓度的DR菌体破碎物。

1.2.3实验分组：按照DR菌液小鼠灌胃给药的浓度分为高浓度活菌组(1×109/mL)、低浓度活菌组(1×107/mL)、高浓度细菌破碎物组(1×109/mL)、低浓度细菌破碎物组(1×107/mL)和灌胃相同体积的胰蛋白胨葡萄糖酵母琼脂培养基(tryptone glucose yeast agar medium，TGY)的TGY培养基组。

1.2.4预实验：SPF级KM小鼠10只，雌雄各半，实验前12 h禁食不禁水，高浓度活菌(1×109/mL)以最大灌胃体积0.4 mL/10 g灌胃，24 h内，每隔6 h灌胃1次，连续灌胃3次，参照王艳秀等[8]的急性毒性小鼠行为学观察指标，记录异常症状小鼠的数量、症状开始时间、结束时间、死亡时间等，观察48 h，计算DR的半数致死量LD50。对48 h后未死亡的小鼠，一侧眼球眶静脉取血于EDTA-k2抗凝管中，左右颠倒充分抗凝，立即进行血常规检测(白细胞、淋巴细胞、红细胞、血红蛋白、红细胞压积、平均红细胞体积、血小板)以及生化指标，血常规检测结束后的抗凝全血，3 000 r/min离心15 min获取血浆用于生化指标的检测(谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总蛋白、肌酐、肌酸激酶、镁、磷、肌酸激酶型同工酶、乳酸脱氢酶)。解剖小鼠，肉眼观察小鼠主要脏器(心、肝、脾、肺、肾、脑及胸腺)有无病理改变，称体质量，根据每只小鼠体质量计算小鼠脏器质量分数。

1.2.5急性毒性实验：取KM小鼠50只随机分为5组，雌雄对半。灌胃前12 h内禁食不禁水，第2天以最大灌胃体积0.4 mL/10 g灌胃菌液2次，间隔8 h，常规饲养观察14 d。记录小鼠异常行为学反应、死亡数量及时间，并记录灌胃后1 d、3 d、5 d、7 d、10 d及14 d的体质量。14 d后，按照预实验的方法，检测血常规及血浆生化指标，测定脏器系数，进行毒理学分析。

脏器系数计算依据下式进行：脏器系数=脏器质量(g)/动物体质量(g)×100%

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 DR急性毒性预实验结果

小鼠在灌胃后0.5 h内有趴窝、安静不动及扎堆现象，0.5 h后恢复正常，之后未见受试小鼠瞳孔改变、眼球凸出、眼睑下垂，未见小鼠分泌物、大小便、呼吸异常及皮肤颜色改变，无小鼠死亡，无法计算出LD50，解剖后肉眼观察主要脏器无明显病理变化，血常规与血液生化指标均在SPF级KM小鼠正常参考指标范围内[9]。

2.2 DR急性毒性正式实验结果

2.2.1DR及其破碎物对小鼠体质量增加的影响：灌胃14 d，与TGY培养基组比较，不同浓度组的小鼠体质量增加，差异不显著(P>0.05)，表明DR对小鼠体质量增长无不良影响(图1)。

图1 DR及其破碎物灌胃小鼠体质量的变化

2.2.2DR活菌及其破碎物对小鼠血常规指标的

影响：灌胃14 d后，与TGY培养基组比较，不同浓度组的小鼠血常规指标差异均不显著(P>0.05)，表明DR对小鼠白细胞、淋巴细胞、红细胞、血红蛋白、红细胞压积、平均红细胞体积、血小板等未产生异常影响(表1)。

表1 DR及其菌体破碎物灌胃后小鼠血常规的测定值

2.2.3DR及其破碎物对小鼠血生化指标的影响：灌胃14 d后，与TGY培养基组比较，不同浓度组的小鼠生化指标差异均不显著(P>0.05)，表明DR对小鼠肝、肾、心等主要脏器功能及镁、磷离子浓度无不良影响(表2)。

表2 DR及其破碎物灌胃后小鼠的血浆生化指标测定值

2.2.4DR及其破碎物对小鼠脏器系数的影响：灌胃14 d后，不同浓度组小鼠主要脏器系数与TGY培养基组比较，除低浓度细菌破碎物组脾脏较其他组有显著增大(P<0.05)外，其他脏器差异均不显著(P>0.05)(表3)。

表3 DR及其破碎物灌胃后小鼠的脏器系数

2.2.5DR及其破碎物灌胃小鼠脾脏器病理学变化：脏器系数比较，发现低浓度细菌破碎物组脾脏系数增大，研究组对DR急性毒性实验组补充了脾脏的组织病理，镜检发现：TGY培养基组小鼠脾脏红白髓细胞排列规则，细胞种类未见明显改变，红白髓比例未见明显变化，红髓脾窦内未见红细胞数量增多(图2A1)，红白髓边缘区近红髓部细胞种类未见改变(图2A2)。DR灌胃小鼠，低浓度组脾脏未见明显病变，红白髓比例未见明显变化(图2B1、图2C1)，红髓脾窦内红细胞数量轻度增加，偶见红髓内静脉轻微扩张(图2B2)，白髓中央动脉周围T细胞数量轻微减少，中央动脉周围淋巴鞘细胞数量轻微减少(图2C2)；高浓度组偶见红白髓比例发生改变，红髓面积扩大，白髓细胞数量有减少趋势(图2D1、图2E1)，局部红髓脾窦内红细胞数量轻微增加，局部红髓内静脉扩张、脾窦轻微水肿(图2D2、图2E2)，白髓中央动脉淋巴鞘细胞数量减少(图2D3、图2E3)。DR及其破碎物灌胃组小鼠脾脏红髓的脾窦、脾索，白髓中的动脉周围淋巴鞘、脾小结，白髓周边向红髓移行的边缘区未见实质性病理变化。

图2 DR活菌及其破碎物灌胃小鼠脾脏病理(HE染色)

3 讨论

急性毒性实验是确定中毒作用方式和中毒反应，为亚急性和慢性毒性实验观察指标及剂量分组提供参考的重要依据，也是新药生物安全评价的重要指标[10]。脏器系数可作为内脏器官损伤的评价标准之一，当脏器系数数值升高，器官出现水肿或充血，脏器系数数值降低，器官出现萎缩或退化[11]。本研究中，DR对小鼠增加体质量及各脏器系数无显著影响，表明DR对小鼠生长影响不大。小鼠血常规及血液生化指标的检测结果，提示DR及其菌体破碎物对小鼠无病理生理上的不良反应。封琼[12]研究表明，在奇球菌属中，DR和D.radiopugnans的类胡萝卜素提取物表现出了最强的抗氧化作用，DR类胡萝卜素可以增加免疫系统中B细胞活力并消灭外源入侵的病原菌，可以提高淋巴T辅助细胞的活力，协助B细胞产生抗体并提高其他免疫组分活性，还可以增加自然杀伤细胞数目，以消除机体内那些被感染的细胞或者癌细胞[13]。本研究结果表明，DR对小鼠增加体质量、脏器系数、血常规及主要脏器相关酶活性及离子浓度无显著影响，低浓度表现出脾脏脏器系数增大，但没有器质性损伤，表现出其潜在的免疫系统促进作用，从而证实了DR为实际无毒菌种。该研究结果与江汉湖等[14]的报道相一致。虽有研究表明益生菌能抑制癌症、肿瘤等的发生，提高机体免疫力，但由于对其作用机理及安全性的研究还不够透彻，所以其作为药品，市场上种类还很少，其主要应用于食品和保健品行业[15]。本研究为推广DR在食品医药卫生上的广泛应用，用小鼠急性毒性实验方法初步验证了DR对于生物体的安全性。