纤维素对结直肠癌小鼠肠道屏障功能及炎症指标影响

李倩倩 陈沉 刘晓涵 慈一帆 宋扬

[摘要] 目的 探討纤维素对氧化偶氮甲烷（AOM）/葡聚糖硫酸钠（DSS）模型小鼠结直肠癌发生发展的抑制作用及其可能的机制。

方法 采用AOM/DSS建立结肠炎症肿瘤模型后，给予不同纤维素含量的AIN-93M饲料，进行干预性实验。实验结束后处死小鼠，计算各组小鼠抑瘤率。采用实时定量PCR（RT-PCR）法检测小鼠结直肠肿瘤组织中Claudin-1、Occludin、闭锁带-1（ZO-1）mRNA表达，Western blot法检测结直肠肿瘤组织中Claudin-1、Occludin、ZO-1蛋白表达，酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测小鼠血清中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-12（IL-12）、环氧化酶-2（COX-2）的表达。

结果 纤维素低、中、高剂量组的抑瘤率分别为47.06%、61.34%、73.95%。与模型组相比，纤维素低、中、高剂量组小鼠结直肠肿瘤组织中Claudin-1的mRNA和蛋白表达水平降低（F=13.34、162.21，P<0.05），而Occludin和ZO-1的mRNA和蛋白表达水平升高（F=40.55～152.56，P<0.05）。与模型组相比，纤维素低、中、高剂量组小鼠血清中TNF-α、COX-2的表达水平明显降低（F=43.15、231.09，P<0.05），IL-12的表达水平明显升高（F=243.45，P<0.05）。

结论 纤维素能够显著抑制炎症性结直肠癌肿瘤的发生，其可能的机制是通过改善肠道屏障功能和改善肠道炎症达到抑癌作用。

[关键词] 纤维素;结直肠肿瘤;炎症;小鼠

[中图分类号] R735.34;R343.93

[文献标志码] A

[文章编号] 2096-5532（2021）03-0445-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.025

[开放科学（资源服务）标识码（OSID）]

[网络出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200821.1555.002.html;2020-08-24 11：45：42

EFFECT OF CELLULOSE ON INTESTINAL BARRIER FUNCTION AND INFLAMMATORY MARKERS IN MICE WITH COLO-

RECTAL CANCER

LI Qianqian， CHEN Chen， LIU Xiaohan， CI Yifan，  SONG Yang

（School of Public Health， Qingdao University， Qingdao 266073， China）

[ABSTRACT]Objective To investigate the inhibitory effect of cellulose on the development and progression of colorectal cancer in a mouse model of colorectal cancer induced by azoxymethane （AOM）/dextran sodium sulfate （DSS） and its possible mechanism.

Methods After the model of colorectal cancer was established by AOM/DSS， the mice were fed with AIN-93M diet containing different contents of cellulose to perform an intervention experiment. The mice were sacrificed at the end of the experiment， and tumor inhibition rate was calculated for each group. RT-PCR and Western blot were used to measure the mRNA and protein expression of Claudin-1， Occludin， and zonula occluden-1 （ZO-1） in colorectal tumor tissue， and ELISA was used to mea-

sure the expression of tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-12 （IL-12）， and cyclooxygenase-2 （COX-2） in serum.

Results The tumor inhibition rates in the low-， middle-， and high-dose cellulose groups were 47.06%，61.34%， and 73.95%， respectively. Compared with the model group， the low-， middle-， and high-dose cellulose groups had significant reductions in the mRNA and protein expression of Claudin-1 （F=13.34，162.21;P<0.05） and significant increases in the mRNA and protein expression of Occludin and ZO-1 （F=40.55-152.56，P<0.05） in colorectal tumor tissue. Compared with the model group， the low-， middle-， and high-dose cellulose groups had significant reductions in the serum levels of TNF-α and COX-2 （F=43.15，231.09;P<0.05） and a significant increase in the serum level of IL-12 （F=243.45，P<0.05）.

Conclusion Cellulose can significantly inhibit the development of inflammatory colorectal cancer， possibly by improving intestinal barrier function and intestinal inflammation.

[KEY WORDS]cellulose; colorectal neoplasms; inflammation; mice

结直肠癌（CRC）是世界上第三大常见的癌症，也是导致癌症死亡的常见原因之一[1]。只有10%的CRC病例具有遗传易感性，高达90%的病例无家族史或遗传易感性[2]。与CRC发展有关的环境因素包括吸烟、酗酒、肥胖、久坐的生活方式、2型糖尿病、红肉的摄入、高脂肪饮食和纤维摄入量不足等。慢性炎症也是CRC发生的重要环境危险因素之一[3]。有研究表明，一些促炎因子如干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）可以通过影响紧密连接（TJ）蛋白的表达，诱导肠道黏膜屏障功能受损[4-5]。而肠道黏膜屏障功能受损，如肠上皮细胞完整性破坏、肠黏膜通透性增加等与炎症相关[6]。肠道屏障功能受损和促炎因子共同作用，促进了CRC的发生发展[7]。纤维素是一种不可溶性膳食纤维，主要存在于蔬菜和水果等植物组织中[8]。有研究发现，补充纤维素可以减轻葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的小鼠炎症，抑制其肿瘤的发生[9-10]。MOEN等[11]的研究结果也表明，纤维素能够降低氧化偶氮甲烷（AOM）诱导的A/J Min+小鼠的肿瘤负荷。纤维素具有抗炎和抗肿瘤作用，其可能的机制是改善了肠道屏障功能，但目前相关研究尚少。因此，本研究通过建立小鼠结直肠炎症肿瘤模型，探讨不同纤维素浓度膳食对结直肠肿瘤发生、炎症及肠道屏障功能的影响。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂

SPF级C57BL/6小鼠100只，雄性，6～8周龄，体质量20～22 g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司（质量合格证号：37009200015329），饲养于清洁级动物饲养室。AOM购自美国SIGMA公司。DSS购自大连美仑生物技术有限公司。纤维素购自北京华迈科生物技术有限责任公司。小鼠饲料购自江苏南通特洛菲饲料科技有限公司，在标准AIN-93M饲料的基础上，脱去或调整纤维素含量制成含0、25、50及100 g/L纤维素的AIN-93M饲料。本研究经青岛大学附属医院伦理委员会审批通过（伦审批件号：QYFYWZLL25668）。

1.2 研究方法

1.2.1 动物模型制备 采用AOM/DSS建立结肠炎症肿瘤模型。第1天，小鼠腹腔注射浓度为1 g/L的AOM 10 mg/kg，7 d后，饮水给予20 g/L的DSS，自由饮水7 d，间隔14 d，循环3个周期，完成模型制备。

1.2.2 动物分组及其干预措施 将100只雄性C57BL/6小鼠按体质量随机分为对照组（CG组，标准AIN-93M饲料喂养）、模型组（MG组，不含纤维素的饲料喂养）、纤维素低剂量组（LCEG组，含25 g/L纤维素饲料喂养），纤维素中剂量组（MCEG组，含50 g/L纤维素饲料喂养）和纤维素高剂量组（HCEG组，含100 g/L纤维素饲料喂养），每组20只。用标准AIN-93M饲料适应性喂养1周后，各组小鼠给予不同纤维素含量的AIN-93M饲料，预防性饮食干预2周后，模型组及纤维素低、中、高剂量组小鼠建立AOM/DSS模型。实验期间，各组小鼠给予相应的AIN-93M鼠粮干预，直至实验结束，实验持续13周。

1.2.3 小鼠一般状态及肿瘤发生情况观察 每周记录小鼠体质量，每2 d记录小鼠进食进水量，观察各组小鼠精神、活动、毛色、饮食和排泄物等情况。于末次干预后24 h，眼球摘除取血;颈椎脱臼处死小鼠，剥离结直肠组织，剖开小鼠结直肠，记录肿瘤发生数（肿瘤最大直径≥2 mm），按下列公式计算抑瘤率。抑瘤率=（模型组肿瘤平均数量-纤维素干预组肿瘤平均数量）/模型组肿瘤平均数量×100%。

1.2.4 小鼠结直肠肿瘤组织Claudin-1、Occludin和闭锁带-1（ZO-1）mRNA表达检测 采用实时定量PCR（RT-PCR）方法分别检测小鼠结直肠肿瘤组织Claudin-1、Occludin、ZO-1 mRNA表达水平。用TRIzol试剂提取组织总RNA，用IMPLEN纳米光度计、P-330核酸检测仪测定mRNA浓度和纯度。本研究中A260/A280比值范围为1.90～2.00，说明样品质量良好。使用Primer Script RT Reagent Kit和Bio-Rad MyCycler PCR仪反向转录RNA（2 μg）。

PCR引物序列见表1。PCR通过Eppendorf Mastercycler EP梯度系统（Eppendorf）根据制造商说明进行操作。反应体积20 μL，进行两步循环，包括95 ℃的变性步骤和60 ℃的退火/延伸联合步骤。GADPH作为内参基因。使用比较式2-△△ct计算基因表达的相对水平。实验重复3次，结果取均值。

1.2.5 小鼠结直肠肿瘤组织Claudin-1、Occludin和ZO-1蛋白表达检测 采用Western blot法检测小鼠结直肠肿瘤组织Claudin-1、Occludin和ZO-1蛋白表達水平。取50～100 mg肿瘤组织，用无菌手术剪将组织剪成细小的碎片，然后加入含磷酸酶抑

制剂的RIPA裂解液，提取肿瘤组织的总蛋白。用BCA蛋白测定法测定蛋白浓度。测定完成后向各组蛋白中加入上样缓冲液，混匀，加热使蛋白变性。蛋白冷却后加入SDS-PAGE凝胶进行电泳分离，将分离后的蛋白分子转移至PVDF膜上。再用含脱脂奶粉的TBST封闭2 h，漂洗3次，加入一抗孵育3～4 h，漂洗后加入二抗孵育2 h。加入ECL发光液在Fusion FX5显影仪中显影，得到目的蛋白条带。以目的蛋白与内参蛋白灰度值的比值表示蛋白的相对表达量。实验重复3次，结果取均值。

1.2.6 小鼠血清中TNF-α、白细胞介素-12（IL-12）和环氧化酶-2（COX-2）的检测 按照酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒说明书操作，在酶标仪上读取450 nm波长处各孔吸光度值，按稀释标准品制作的标准曲线计算出样本中细胞因子含量。

1.3 统计学分析

应用SPSS 17.0统计软件进行数据处理及统计学分析，计量资料以±s表示，多组比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结  果

2.1 各组小鼠一般状态及肿瘤发生情况

除CG组外，在饮水中加入20 g/L的DSS期间及之后1周内，其他各组小鼠均出现毛色无光泽，呈静电样改变，活动减少，粪便性状改变，以及稀便、脱肛、血便等症状。但随着正常饮水，以上现象均会改善。CG、MG、LCEG、MCEG和HCEG组小鼠的存活率分别为100%（20/20）、55%（11/20）、75%（15/20）、85%（17/20）和90%（18/20）。实验结束之后解剖小鼠，观察并记录肿瘤的发生情况。LCEG、MCEG、HCEG组小鼠结直肠肿瘤数量较MG组减少，MCEG、HCEG组较LCEG组减少，HCEG组较MCEG组减少，差异均有显著意义（F=93.23，P<0.05）。LCEG、MCEG和HCEG组的抑瘤率分别为47.06%、61.34%和73.95%。见表2。

2.2 各组小鼠结直肠肿瘤组织Claudin-1、Occludin、ZO-1 mRNA表达比较

研究结果表明，MG组小鼠结直肠肿瘤组织中的Claudin-1 mRNA表达水平较CG组明显升高，而LCEG、MCEG、HCEG组Claudin-1 mRNA表达水平较MG组明显降低，差异有统计学意义（F=13.34，P<0.05）。MG组小鼠结直肠肿瘤组织中的Occludin、ZO-1 mRNA表达水平较CG组明显降低，而MCEG、HCEG组Occludin、ZO-1 mRNA表达水平较MG组明显升高，差异均有显著性（F=152.56、65.30，P<0.05）;MG组和LCEG组小鼠结直肠肿瘤组织中ZO-1、Occludin mRNA表达水平差异无显著性（P>0.05）。见表3。

2.3 各组小鼠结直肠肿瘤组织Claudin-1、Occludin、ZO-1蛋白表达的比较

MG组小鼠结直肠肿瘤组织中Claudin-1蛋白表达水平较CG组明显升高，LCEG、MCEG、HCEG组Claudin-1蛋白表达水平较MG组明显降低，差异均有显著性（F=162.21，P<0.05）。MG组小鼠结直肠肿瘤组织中Occludin、ZO-1蛋白表达水平较CG组明显降低，LCEG、MCEG、HCEG组Occludin 蛋白表达水平较MG组明显升高，MCEG、HCEG组ZO-1蛋白表达水平较MG组明显升高，差异均有显著性（F=115.12、40.55，P<0.05）;而MG组和LCEG组小鼠结直肠肿瘤组织中ZO-1 蛋白表达水平差异无显著性（P>0.05）。见图1、表4。

2.4 各组小鼠血清中炎症因子表达的比较

与CG组相比，MG、LCEG、MCEG和HCEG组小鼠血清中TNF-α、COX-2的表达水平明显升高，IL-12的表达水平明显降低;与MG组相比较，LCEG、MCEG和HCEG组小鼠血清中TNF-α的表达水平明显降低，IL-12的表达水平明显升高，MCEG和HCEG组小鼠血清中COX-2的表达水平明显降低（F=43.15～243.45，P<0.05）。MG组和LCEG组小鼠血清中COX-2的表达水平差异无显著性（P>0.05）。见表5。

3 讨  论

研究表明，纤维素可以减轻肠道炎症和抑制肿瘤发生[8-9]。本研究通过AOM/DSS诱导成功建立小鼠结直肠炎症肿瘤模型，用含不同浓度纤维素的饲料进行干预，结果显示，与MG组相比，纤维素干预能够使AOM/DSS诱导的CRC小鼠的肿瘤数量降低，增加结直肠肿瘤的抑瘤率。另外，本研究还显示，纤维素干预能够影响小鼠结直肠肠道屏障功能。

TJ由跨膜蛋白（如Occludins、Claudins）和连接黏附分子以及外周膜蛋白（如zona occludens，ZO-1、-2、-3）等组成[10]。在健康状态下，TJ蛋白能够构建一种动态的肠道屏障，调节细胞间隙对水、营养物质和电解质的摄取。而TJ功能障碍可以破坏肠道屏障的完整性，促进肠道炎症以及结直肠肿瘤的发生[11]。Claudin-1能启动TJ结构的形成活性，其过度表达可导致肠上皮细胞分化，使肠黏膜受损[12]。Occludin在胞外环和跨膜区选择性调节细胞间隙的通透性[13]。ZO-1能够与Occludin相结合，调节细胞间隙通透性，在细胞间具有黏附作用[14]。下调ZO-1的表达，能够阻断和破坏TJ复合体的完整性，增加上皮通透性[15]。

慢性炎症和癌症之间的联系密切[2]。炎症性肠病（IBD）包括溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD），该病病人患CRC的风险显著增加[16]。有研究显示，与健康对照组相比，UC病人结肠组织中Claudin-1蛋白表达上调[17]。PORITZ等[18]的研究结果也显示，UC病人结肠样本中Claudin-1蛋白的表达增加，Occludin蛋白的表达减少。KUCHARZIK等[19]的研究则显示，UC和CD病人结直肠组织中的Occludin蛋白表达下调。SOLER等[20]研究表明，在人类和大鼠中，肠肿瘤周围区域的TJ通透性增加;在人類肠道的肿瘤丰富区域TJ蛋白ZO-1和Occludin表达减少。纤维素能够改善肠道黏膜屏障功能，抑制肠道炎症及肿瘤的发生发展[8-9]。与上述研究结果一致，本研究结果也显示，AOM/DSS诱导的结直肠炎症肿瘤模型小鼠结直肠肿瘤组织中Claudin-1的表达水平明显升高，Occludin、ZO-1的表达水平明显降低;纤维素干预后，Claudin-1的表达水平明显降低，Occludin、ZO-1的表达水平明显升高。表明AOM/DSS诱导的结直肠炎症肿瘤模型小鼠，其TJ功能受损，结直肠肠道屏障的完整性被破坏，而纤维素的干预使TJ功能得到一定程度的恢复，从而保护肠道屏障的完整性。

腸黏膜屏障功能受损可能与肠道炎症有关，因此本研究还检测了小鼠血清中的炎症相关指标。TNF-α可以通过增加肌球蛋白轻链激酶磷酸化影响TJ，降低上皮屏障功能[21]。本文研究结果显示，AOM/DSS诱导的结直肠炎症肿瘤模型小鼠血清中TNF-α的表达水平明显升高，在纤维素干预后，小鼠血清中TNF-α的表达水平明显降低，肠道炎症改善。表明纤维素干预可能通过调控炎症因子TNF-α表达，改善肠道屏障功能。IL-12在抗肿瘤免疫及抗感染免疫中起重要作用，与正常人相比，CRC病人外周血中IL-12的表达水平明显降低[22]。本研究中，IL-12在结直肠炎症肿瘤模型小鼠血清中的表达水平明显降低，在纤维素干预各组中的表达水平明显升高。COX-2在炎症过程中是重要的限速酶，其高表达与慢性炎症和肿瘤的发生有关[23]。本研究结果显示，在结直肠炎症肿瘤模型小鼠血清中COX-2的表达水平明显升高，在纤维素干预组中其表达水平明显降低。可见，纤维素干预可使结直肠炎症肿瘤模型小鼠的肠道炎症减轻。

综上所述，纤维素干预能够减少AOM/DSS诱导的模型小鼠的肿瘤数;降低小鼠结直肠肿瘤组织中Claudin-1的表达，升高Occludin、ZO-1的表达，改善肠道屏障功能;降低小鼠血清中TNF-α、COX-2的表达水平，升高IL-12的表达水平，减轻肠道炎症。纤维素干预可能通过改善AOM/DSS诱导的结直肠炎症肿瘤模型小鼠的肠道屏障功能，减轻其肠道炎症，而抑制结直肠肿瘤的发生。但相关机制还需进一步研究。

[参考文献]

[1]FREDDIE B， JACQUES F， ISABELLE S， et al. Global can-

cer statistics 2018：GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J].  CA： A Cancer Journal for Clinicians， 2018，68（6）：394-424.

[2]LONG A G， LUNDSMITH E T， Hamilton K E. Inflammation and colorectal cancer[J].  Curr Colorectal Cancer Rep， 2017，13（4）：341-351.

[3]FAZIO V， ROBERTIS M， MASSI E， et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis： from pathways to diagnosis and therapy studies[J].  Journal of Carcinogenesis， 2011，10（1）：9.

[4]VANCAMELBEKE M， VERMEIRE S. The intestinal bar-

rier： a fundamental role in health and disease[J].  Expert Rev Gastroenterol Hepatol， 2017，11（9）：821-834.

[5]BARMEYER C， SCHULZKE J D， FROMM M. Claudin-related intestinal diseases[J].  Semin Cell Dev Biol， 2015，42（1）：30-38.

[6]SNCHEZ DE MEDINA F， ROMERO-CALVO I， MASCARAQUE C， et al. Intestinal inflammation and mucosal barrier function[J].  Inflamm Bowel Dis， 2014，20（12）：2394-2404.

[7]DIAKOS C I， CHARLES K A， MCMILLAN D C， et al. Cancer-related inflammation and treatment effectiveness[J].  Lancet Oncol， 2014，15（11）：e493-e503.

[8]CUMMINGS J H. Cellulose and the human gut[J].  Gut， 1984，25（8）：805-810.

[9]WU W T， YANG L C， CHEN H L. Effects of konjac glucomannan， inulin and cellulose on acute colonic responses to genotoxic azoxymethane[J].  Food Chemistry， 2014，155：304-310.

[10]SCHOULTZ I， KEITAV. Cellular and molecular therapeutic targets in inflammatory bowel disease-focusing on intestinal barrier function[J].  Cells， 2019，8（2）：193.

[11]LANDY J， RONDE E， ENGLISH N， et al. Tight junctions in inflammatory bowel diseases and inflammatory bowel disease associated colorectal cancer[J].  World J Gastroenterol， 2016，22（11）：3117-3126.

[12]OUBAN A. Claudin-1 role in colon cancer： an update and a review[J].  Histol Histopathol， 2018，33（10）：1013-1019.

[13]FURUSE M， HIRASE T， ITOH M， et al. Occludin： a novel integral membrane protein localizing at tight junctions[J].  J Cell Biol， 1993，123（6 Pt 2）：1777-1788.

[14]FURUSE M， ITOH M， HIRASE T， et al. Direct association of occludin with ZO-1 and its possible involvement in the loca-

lization of occludin at tight junctions[J].  J Cell Biol， 1994，127（6 Pt 1）：1617-1626.

[15]DRAGO S， EL ASMAR R， DI PIERRO M， et al. Gliadin， zonulin and gut permeability： effects on celiac and non-celiac intestinal mucosa and intestinal cell lines[J].  Scandinavian Journal of Gastroenterology， 2006，41（4）：408-419.

[16]YANG D H. Recent advances in understanding colorectal can-

cer and dysplasia related to ulcerative colitis[J].  Korean J Gastroenterol： Taehan Sohwagi Hakhoe Chi， 2015，66（6）：312-319.

[17]POPE J L， BHAT A A， SHARMA A， et al. Claudin-1 regulates intestinal epithelial homeostasis through the modulation of Notch-signalling[J].  Gut， 2014，63（4）：622-634.

[18]PORITZ L S， HARRIS L R， KELLY A A， et al. Increase in the tight junction protein claudin-1 in intestinal inflammation[J].  Dig Dis Sci， 2011，56（10）：2802-2809.

[19]KUCHARZIK T， WALSH S V， CHEN J， et al. Neutrophil transmigration in inflammatory bowel disease is associated with differential expression of epithelial intercellular junction proteins[J].  The American Journal of Pathology， 2001，159（6）：2001-2009.

[20]SOLER A P， MILLER R D， LAUGHLIN K V， et al. Increased tight junctional permeability is associated with the development of colon cancer[J].  Carcinogenesis， 1999，20（8）：1425-1431.

[21]AL-SADI R， GUO S H， YE D M， et al. TNF-α modulation of intestinal tight junction permeability is mediated by NIK/IKK-α axis activation of the canonical NF-κB pathway[J].  The American Journal of Pathology， 2016，186（5）：1151-1165.

[22]LU X J. Impact of IL-12 in cancer[J].  Current Cancer Drug Targets， 2017，17（8）：682-697.

[23]ALBASRI A， ELKABLAWY M， HUSSAINY A， et al. Impact of COX-2 over-expression on the prognosis of colorectal cancer patients. An expression from Western Saudi Arabia[J].  Saudi Med J， 2018，39（8）：773-780.

（本文編辑 马伟平）