UPLC-MS/MS测定大米中伏马毒素、呋虫胺及其代谢物的残留量

赵健， 许秀琴， 吕燕

(宁波市农业科学研究院 宁波市农产品质量检测中心，浙江 宁波 315040)

呋虫胺作为新型烟碱类杀虫剂，已广泛应用于水稻虫害的防治，对二化螟、稻飞虱等具有良好的防效。但随着呋虫胺的大量使用，呋虫胺在环境、植物中残留风险也随之增大，对人和动物产生间接危害[1]。2012年农药残留联席会议(JMPR)，规定呋虫胺在植物体内的残留定义为呋虫胺、UF及DN之和[2]。伏马毒素是水稻在生长或储存过程中被真菌污染后而不断产生的毒素，即使在低浓度范围内也会对人和动物正常生理功能产生干扰和产生毒害[3-4]。

目前，国内单独检测伏马毒素或呋虫胺及代谢物的方法已有报道，呋虫胺及其代谢物主要采用液相色谱法[5-6]和液相色谱串联质谱法[7-8]等进行检测，伏马毒素主要采用酶联免疫技术[9-10]、液相色谱法[11-12]和液相色谱串联质谱法[13-14]等进行检测，但同时测定伏马毒素、呋虫胺及其代谢物的检测方法仍较少见。

本文开发了一种基于UPLC-MS/MS的检测方法，可同时提取、净化和测定伏马毒素B1、伏马毒素B2、呋虫胺、DN和UF，方法简便、准确、重现性好，满足大米中5种药物快速定性定量检测分析。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乙腈、甲酸、甲醇为色谱纯；净化材料N-丙基乙二胺、弗罗里硅土购于上海安谱，多壁碳纳米管购于江苏先丰；试验用水为超纯水；伏马毒素B1、伏马毒素B2购于TRC，呋虫胺、DN、UF购于anpel，大于95%；大米磨粉后，-20 ℃保存。Waters UPLC-XEVO TQ MS超高效液相色谱串联质谱仪；SIGMA 3K15离心机；Mettler-Toledo XPE205电子天平、PL3002电子天平；IKA控温摇床；Organomation N-EVAP112氮吹仪；IKA T25 digital匀浆机。

1.2 溶液配制

1.2.1 储备标液配制

分别准确称取伏马毒素、呋虫胺等适量固体标样，用乙腈溶解，得到100 mg·L-1储备液；用乙腈稀释配制5 mg·L-1工作液。

1.2.2 基质标液配制

按1.3节得到的空白基质溶液，将5 mg·L-1标准工作溶液依次稀释至100、50、20、10、5、2 μg·L-1基质标准溶液，现配现用。

1.2.3 提取溶液配制

按照体积比，移取适量乙腈、超纯水和甲酸试剂，配制乙腈/水(体积比85∶15)、乙腈/水/甲酸(体积比85∶14∶1)、乙腈/水(体积比75∶25)、乙腈/水/甲酸(体积比75∶24∶1)4种提取液。

1.3 样品前处理

准确称大米粉5.00 g于塑料离心管，添加20 mL提取液，匀浆机10 000转·min-1匀浆1 min，摇床振荡15 min，9 000转·min-1离心5 min。分取4.00 mL提取液到含40 mg多壁碳纳米管的离心管，9 000转·min-1涡旋1 min，再离心3 min；分取2.50 mL净化溶液至另一离心管，氮吹仪上水浴40 ℃吹近干，用1 mL乙腈/0.1%甲酸水溶液(体积比1∶9)溶解残液，过0.22 μm滤膜，UPLC-MS/MS测定。

1.4 超高效液相色谱条件

色谱柱为Waters UPLC BEH Shield RP18，1.7 μm，柱温40 ℃，样品室温度20 ℃，流速0.3 mL·min-1；流动相为乙腈(A)和0.1%(体积比)甲酸水溶液(B)。

梯度洗脱。0～1 min(10%A)，1～3 min(10%A～50%A)，3～5 min(50%A～90%A)，5～6 min(90%A)，6～6.1 min(90%A～10%A)，6.1～9 min(10%A)，进样量10 μL。

1.5 质谱条件

电喷雾离子源，正离子扫描，多反应监测，毛细管电压2.5 KV，雾化气1 000 L·h-1，锥孔气50 L·h-1；源温150 ℃；雾化温度500 ℃。各化合物的质谱条件如下：伏马毒素B1，定性离子对722.30/352.29(m/z，下同)，定量离子对722.30/334.28，锥孔电压50 V，碰撞能量36、42 V；伏马毒素B2，定性离子对706.30/354.29，定量离子对706.30/336.33，锥孔电压48 V，碰撞能量32、38 V；呋虫胺，定性离子对203.10/113.28，定量离子对203.10/129.02，锥孔电压14 V，碰撞能量10、12 V；UF，定性离子对159.10/85.00，定量离子对159.10/102.04，锥孔电压16 V，碰撞能量14、10 V；DN，定性离子对158.17/67.00，定量离子对158.17/102.06，锥孔电压32 V，碰撞能量20、12 V。

2 结果与分析

2.1 前处理方法的优化

2.1.1 提取溶剂的优化

大米中含水量较低，含有丰富淀粉和蛋白质等营养组分。文中选择药物均含有酸碱性基团，所以在优化提取液时，选择可有效沉淀蛋白等杂质的乙腈为有机相，另加入少量水或酸性水溶液，以提高回收率。本文测试了1.2.3节中配制的4种提取液，结果表明，当水相为纯水时，伏马毒素回收率均低于40%，当水相含有甲酸时，回收率均在70%～120%；而呋虫胺及其代谢物在4种提取液中回收率均在70%～120%。为提高方法灵敏度，需对提取液进行浓缩，最终选择乙腈/水/甲酸(体积比85∶14∶1)作为提取液。

2.1.2 净化材料的选择

样品提取后，提取液中仍含有影响组分灵敏度或干扰组分峰形的杂质，虽使用的仪器具有很强的抗干扰能力，但仍会出现组分在大米样品中的基质效应，因此，需对提取液进行净化。本文选择N-丙基乙二胺、弗罗里硅土和多壁碳纳米管等净化材料对提取液进行净化。结果表明，弗罗里硅土对DN具有较强的吸附作用，回收率均在60%以下；而多壁碳纳米管、N-丙基乙二胺均取得较好的回收率，但多壁碳纳米管具有更好的净化效果，4 mL提取液中最佳使用量为40 mg。

2.2 色谱条件的优化

为优化5种药物的流动相体系，得到更好的灵敏度和分离度，本文对甲醇+水、乙腈+水、甲醇+0.1%甲酸水溶液和乙腈+0.1%甲酸水溶液4种流动相体系进行了优化筛选。结果表明，水相为纯水时，2种伏马毒素峰形很差；水相为0.1%甲酸水时，5种药物峰形均得到较好改善；乙腈作为流动相灵敏度优于甲醇，故选择乙腈+0.1%甲酸水溶液作为流动相。

2.3 质谱条件的优化

5种药物电离化模式均采用ESI+。将药物配成2 mg·L-1，使标样随着选定的流动相进入质谱，通过调节得到各种药物的母离子，然后应用仪器软件优化得到目标物、定性定量离子的毛细管电压、锥孔电压和碰撞能量等，建立MRM方法。

2.4 方法学验证

2.4.1 基质效应

大米提取液虽然经过净化，但仍可能存在对检测药物具有较强基质效应的杂质，若使用试剂配制标样，则会对检测结果造成较大偏差。因此，验证净化溶液的基质效应就显得很有必要。分别用试剂和基质空白配制浓度依次为100、50、20、10和2 μg·L-1的2种系列标准工作溶液，经仪器分析后，计算2种标准溶液的线性回归方程及其斜率比。由表1中试剂和基质空白标样的斜率比可以看出，DN斜率比均超出0.8～1.2的阈值，说明在大米基质中仍有较强的基质效应，故最终选择基质标样进行定量。

2.4.2 基质标准曲线和定量限

在优化的液相和串联质谱条件下，对大米基质空白配制的100、50、20、10、5和2 μg·L-1的系列标准工作溶液进行仪器检测，并绘制标准工作曲线。表1显示，在2～100 μg·L-1各种药物的决定系数在0.999 2～0.999 6。经加标试验，以10倍信噪比时空白基质加标浓度为方法定量限。

表1 溶剂标液和基质标液的线性回归方程和斜率比

表2 不同处理及标液对添加回收率、相对标准偏差和定量限的影响

2.4.3 准确度与精密度

取大米空白样品，添加5、20、80 μg·kg-13个浓度水平，5次平行，结果见表2。各处理准确度回收率83.6%～111.0%，精密度RSD2.2%～11.0%，满足大米中5种药物定性定量检测，谱图见图1。

图1 20 μg·L-1基质标液MRM色谱

2.5 样品检测

通过检测，获得的12个大米样品检测结果，有2个样品检出呋虫胺和UF，呋虫胺含量为29.6～86.8 μg·kg-1，UF为15.9～28.2 μg·kg-1；DN和2种伏马毒素均未检出。

3 小结

文中建立起一种可实现大米中伏马毒素B1、伏马毒素B2、呋虫胺、DN和UF 5种药物同时提取、净化、检测的快速分析方法，方法简单、快速、重现性好，适用于大米中5种药物同时定性定量快速分析。