油菜素内酯对Pb胁迫下番茄幼苗生理特性的缓解效应

史沉鱼， 韦云秀

(河池学院 化学与生物工程学院，广西 宜州 546300)

近几年来，由于经济的快速发展，土壤中重金属污染造成的农业经济损失问题受到世界许多国家的关注[1]。2006年全国土壤现状调查显示，全国受污染的耕地约有1 000万hm2，据估算，全国粮食因重金属污染造成的经济损失超过200亿元[2]。2011年2月，国务院正式批复《重金属污染综合防治十二五规划》，这是我国出台的第一个“十二五”专项规划，充分体现了国家对重金属污染防治的重视程度[3]。Pb是土壤环境污染中受关注度较高的重金属之一，具有积累性、隐蔽性、难治性和长期性等特点[4]，对环境和生物体健康的影响也备受关注[5-6]。研究表明，高浓度Pb能抑制小麦种子萌发，降低发芽率，显著抑制茎、株高和根的生长[7-10]。随着Pb浓度的增加和处理时间的延长，南瓜中Pb的积累量也不断增多[11]。高浓度Pb能抑制金银花的生长，使其叶绿素含量降低，产量下降[12]。在小麦幼苗、竹柏幼苗、瓜果类和一些草本植物中，重金属对其生理生长影响的相关研究也很多[13-19]。

油菜素内酯(EBR)作为第六大植物激素，能通过调控植物生长发育来提高产量品质。油菜素内酯对植物生理方面影响的研究已经取得显著进展，对抗逆性的影响的研究包括低温、高温、渍水、干旱、低氧、弱光、重金属、农药污染等。研究发现，外源喷施EBR能有效改善油菜幼苗植株气孔的限制，通过提高其光合作用和水状况来提高耐盐性[20]。外源EBR作用于水稻后，通过提高抗氧化酶活性和调节内源激素来缓解高温胁迫对水稻的结实率的影响，从而保证水稻的产量[21]。尹博[22]的研究表明，EBR能缓解铜胁迫对番茄植株的危害。重金属Pb胁迫下缓解施用一定量的EBR，能增加株高，增大叶面积，增粗茎秆，提高坐果率，以提高作物产量[23-24]。虽然EBR在植物生长发育和信号转导等生理和分子作用机制的研究已取得了显著成绩，但在不同重金属胁迫下EBR对植物生理的改善有待进一步研究。

番茄营养价值丰富，是重要的果蔬之一，其品质的安全关系到人的健康，同时也涉及种植户的经济效益，在植物富集重金属、植物修复及EBR对重金属胁迫的缓解效应方面都有研究，但Pb胁迫下的研究鲜见报道。本文探究Pb处理后番茄种子和幼苗生长的生理变化以及幼苗叶面喷施EBR后番茄的响应，旨在了解Pb胁迫对种子及幼苗的影响及EBR对胁迫的缓解效应，对提高番茄产量和品质具有一定的经济价值和现实意义。

1 材料与方法

1.1 植物材料的培养及设计

供试材料番茄品种为中蔬四号，挑选出颗粒饱满且形态相近的种子，用40 ℃温水浸种3～4 h，捞出擦干后再用1% KMnO4消毒，冲洗净残留，用滤纸擦干种子，置于培养皿中培养。每天用浓度分别为50、100、200、300、400 mg·L-1的5 mL Pb溶液进行胁迫处理，对照组(CK)使用等量清水处理。每天观察种子发芽和幼苗生长状况，当番茄幼苗长至27 d后，叶面喷施0.1 mg·L-1EBR(正反面均要喷施，喷施量以叶面滴水为准)，第33天进行各项生理指标的测定。每处理设10盆，每盆3株，重复3次。

1.2 化学试剂及仪器

试剂：硝酸铅、油菜素内酯(EBR)、浓硫酸、蒽酮、乙醇、磷酸、标准葡萄糖溶液、考马斯亮蓝。仪器：紫外分光光度计、离心机、漏斗、研钵、具塞比色管、玻璃棒、容量瓶、试管、烧杯、比色管、直尺、卷尺、电子天平、镊子、手术刀、离心管、盖玻片、移液管、培养皿、培养箱。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 形态指标的测定

番茄幼苗叶面喷施EBR 6 d后，每个处理选取健康的番茄幼苗用卷尺或尺子进行相关测量，精确到0.1 cm，每次测量重复5次。根长为根与茎的分隔处到主根根尖的距离；株高为从根与茎的分隔处到植株最高点的长度；茎粗为子叶节下部1 cm处的直径；记录真叶数。

1.3.2 生理指标的测定

参照杨敏文[25]的丙酮-乙醇提取法进行叶绿素含量的测定，按照Arnon公式[26]计算;可溶性蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝法[27]。

1.3.3 气孔指标的测定

参考杨再强[28]等的方法，在10:00～12:00时选取健康的番茄植株，采摘根部往上第3～4片的真叶，蒸馏水冲洗干净后用纸巾擦干，然后将叶片放在缓冲液下光照3 h，滤纸吸干多余液体后，用透明胶黏贴法制片，将叶片下表皮平铺黏贴在透明胶上，黏贴好后快速撕取表皮，连同透明胶一起黏贴在载玻片上，将样片置于光学显微镜(Olympus CX-31)×40倍下进行气孔长度、开度、密度的测定[29]。

1.4 数据分析

试验数据整理分析以及图表的绘制使用Excel 2010和SPSS 22.0，采用单因素方差分析和LSD检验对各项指标进行显著差异分析。

2 结果与分析

2.1 外源EBR对Pb胁迫下番茄幼苗外观形态的影响

株高、根长、茎粗和真叶长势等外观形态指标可作为植物生长发育是否健康的依据之一。由表1可知，株高在各浓度Pb处理下与对照组的生长基本上一致，总体上呈增长趋势。当Pb浓度为200 mg·L-1时，株高值达到最大，比对照增长16.6%，与对照组差异显著，其他处理组与对照组差异不显著。

表1 外源EBR对Pb胁迫下番茄幼苗外部形态的影响

植物通过根的吸收，把重金属运输到全身，Pb的毒害作用最开始作用于植物根部。Pb胁迫对番茄幼苗根的伸长产生抑制作用，根长均低于对照，分别降低41.3%、12.1%、16.7%、9.6%、18.7%。当Pb浓度为50、200、400 mg·L-1时，与对照组差异显著。

各浓度Pb处理茎粗与对照间差异不显著。处理能有效促进叶的生长，增加真叶数。当Pb浓度为50 mg·L-1时，真叶数显著低于对照，当Pb浓度为200、400 mg·L-1时，真叶数显著高于对照。由此说明，在Pb胁迫下对番茄幼苗茎叶喷施EBR，能增加茎粗，加快真叶生长，对茎和叶的生长起到促进作用。

2.2 外源EBR对Pb胁迫下番茄幼苗生理指标的影响

2.2.1 叶绿素含量

叶绿素含量越高，说明植物光合作用越强，反之则越弱。叶绿素的合成与植物体内光合作用酶和电子传递链有关，除植物本身的影响外，外界因素也会产生一定影响。Pb在番茄中积累，使植物生理系统紊乱，从而破坏叶绿体结构，降低叶绿素含量，导致植物光合作用受阻，影响植物生长。

从表2可以看出，50～300 mg·L-1浓度Pb处理下，与对照相比，叶绿素a分别降低了9.5%、7.4%、10.7%、17.4%，当Pb浓度为400 mg·L-1时，叶绿素a含量比对照略有增加，但差异不显著。叶绿素b、叶绿素a+b含量也均有所下降，除了Pb浓度为50、400 mg·L-1降低不显著外，其他均显著低于对照。在Pb胁迫处理下外源喷施EBR，叶绿素a/b的值并未随着Pb浓度的升高而降低，基本高于对照，说明外源EBR能提高番茄幼苗中叶绿素a/b的值，能缓解Pb胁迫对番茄生长的毒害作用。

表2 外源EBR对Pb胁迫下番茄幼苗叶绿素含量的影响

2.2.2 可溶性蛋白含量

高等植物能通过光合作用积累可溶性蛋白、调节体内渗透压来增强植物对重金属胁迫的抗性。当植物受到逆境胁迫时，通过可溶性蛋白的积累来缓解逆境对植物体的伤害，具有维持渗透压的作用，是衡量植物抵抗不良环境的重要指标之一。

从图1中可以看出，在Pb浓度为50 mg·L-1时，番茄叶片中可溶性蛋白显著低于对照，其他处理浓度均接近或高于对照组，但差异不显著。其中，Pb浓度为200 mg·L-1时，叶片中可溶性蛋白含量最高。

柱间无相同字母表示组间差异显著(P<0.05)。图3、4同。图1 外源EBR对Pb胁迫下番茄幼苗可溶性蛋白含量的影响

2.3 外源EBR对Pb胁迫下番茄幼苗叶片气孔的影响

2.3.1 叶片气孔长度与开度

由图2、3可知，Pb处理下番茄叶片气孔长度呈增加趋势，且随着Pb浓度的升高，气孔长度增大，分别比对照组增加24.1%、5.4%、24.0%、23.2%、35.0%；除Pb浓度为100 mg·L-1时对气孔长度影响不显著外，其他处理均达到显著差异；Pb浓度为400 mg·L-1时，气孔长度最大。Pb处理的气孔开度高于对照组，分别增加26.7%、2.8%、23.1%、0.5%、12.1%。Pb浓度为50、200 mg·L-1时，气孔开度显著高于对照。

图2 EBR处理对Pb胁迫下番茄气孔形态的影响

图3 外源EBR对Pb胁迫下番茄幼苗叶片气孔长度与开度的影响

2.3.2 叶片气孔密度

从图2、4可以看出，Pb胁迫下番茄幼苗叶片气孔密度呈先降低后升高再下降的趋势。当Pb浓度在200 mg·L-1时，气孔密度达到最大，较对照组增加3.3%，但与对照组差异不显著。当Pb浓度为50、100、300、400 mg·L-1时，气孔密度均低于对照组，浓度为50和400 mg·L-1时与对照差异显著。

图4 外源EBR对Pb胁迫下番茄幼苗叶片气孔密度的影响

3 讨论

3.1 外源EBR对Pb胁迫下番茄幼苗外观形态的影响

Pb作为植物生长的非必需元素，高浓度Pb能破坏植物内部结构，抑制植物生长。Pb能通过拮抗作用导致植物一系列生理生化过程紊乱，影响植物生长发育，主要表现为叶片失绿黄化、茎秆细弱、根系变短和植株矮小。有研究表明，外源喷施EBR能促进小麦株高增加，增加根茎叶的质量。本试验中，对不同Pb浓度处理的番茄幼苗叶片喷施EBR，其株高、根长、茎粗、真叶数随着Pb胁迫浓度的升高逐渐下降，与对照组相比差异不显著，可见EBR可促进植株增高、茎秆增粗以及根长和叶的生长，这与孙士林等[30]的研究结果一致。

3.2 外源EBR对Pb胁迫下番茄幼苗生理指标的影响

3.2.1 叶绿素含量

叶绿素在植物光合作用中对光能的吸收、传递和转化起到核心作用。Pb能通过影响电子传递链、光合系统和相关酶活性来降低叶绿素的合成。Pb浓度过高会降低植物对镁和铁的吸收，影响铁进入叶绿素的卟啉环，从而减少叶绿素分子的产生，导致叶绿素合成降低。本试验中，对不同浓度Pb胁迫处理下的番茄幼苗叶面喷施EBR，随着Pb胁迫浓度的升高，叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b的含量逐渐下降，当浓度达到400 mg·L-1时，叶绿素含量又呈回升趋势，说明外源EBR能缓解Pb胁迫对番茄幼苗叶绿素等光合系统的破坏，降低对植物光合作用的影响。EBR能通过增加植物叶绿素的含量来缓解重金属对植物光合作用的影响，试验中随着处理浓度的增加逐渐增大，这与叶绿素a、叶绿素b的变化有关，说明EBR对Pb胁迫具有一定的缓解作用，但不同浓度的胁迫对植物影响不同，相关作用机理还有待进一步研究。

3.2.2 可溶性蛋白含量

在低浓度处理下，当Pb离子进入植物体内时，植物通过启动自身防御系统形成相关蛋白与金属离子的结合，降低重金属对植物体的毒害。本试验中，可溶性蛋白的含量先下降再升高后下降。在50 mg·L-1Pb处理下，番茄幼苗细胞内的蛋白合成酶受到毒害，从而降低了幼苗中的可溶性蛋白含量；当浓度达到100 mg·L-1后，番茄幼苗抵抗系统达到一定阈值，Pb离子刺激金属螯合蛋白生成，可溶性蛋白含量逐渐升高。随着Pb浓度的升高，番茄自身防御系统遭到破坏，无法通过自身调节抵御毒害，相关酶的合成及代谢系统紊乱或被破坏，可溶性蛋白含量下降。外源EBR作用后，提高了番茄幼苗可溶性蛋白含量，增强了对Pb的抗性。这与王芳[31]等研究EBR能对Pb胁迫下玉米幼苗缓解作用一致。

3.3 外源EBR对Pb胁迫下番茄幼苗叶片气孔的影响

3.3.1 叶片气孔长度与开度

本试验中，随着Pb处理浓度增加，气孔的长度、开度均增大，气孔长度的增幅比开度更为明显。当浓度达到400 mg·L-1时，气孔长度达到最大值，说明随着处理浓度的升高，气孔的抵御能力也在不断增加。气孔开度受胁迫影响较小，基本与对照组一致，说明外源EBR能降低Pb离子对幼苗保卫细胞的毒害，叶面喷施EBR对气孔的开放起到促进作用，从而缓解Pb对番茄幼苗呼吸作用和光合作用的影响。对蚕豆气孔的研究表明，EBR能诱导气孔关闭，有显著抑制ABA诱导气孔关闭的效应[32]，与本试验Pb胁迫下缓解抑制作用一致。

3.3.2 叶片气孔密度

气孔密度反映出植物叶片气孔的分布情况，其与气孔长度、开度等多种因素有关。陈强等[33-35]研究表明，在重金属胁迫处理下，气孔密度呈下降趋势。本试验中，Pb胁迫处理下对番茄幼苗叶面喷施EBR，气孔密度先下降再上升后下降，可能与EBR的缓解作用有关，降低了Pb对气孔的毒害作用。

4 小结

在对番茄进行Pb胁迫处理时，番茄幼苗的响应机制表现为低浓度促进、高浓度抑制。当Pb浓度达到100 mg·L-1时，能显著抑制种子的发芽势和发芽率以及幼苗株高、根长、茎粗、真叶的生长，随着处理浓度的升高，体内叶绿素含量降低，光合作用能力下降。Pb胁迫下，番茄启动自身防御系统，通过增加可溶性蛋白含量来抵抗Pb胁迫的毒害作用。Pb胁迫下气孔长度、开度及密度均会下降。0.1 mg·L-1EBR能明显促进番茄生长，为最适促进浓度。在本试验中，外源喷施EBR能有效缓解Pb胁迫对番茄幼苗株高、根长、茎粗和真叶生长的抑制作用，表现出各生长指标差异不显著；叶绿素含量和可溶性蛋白含量与对照相近；气孔长度、开度、密度的值均有所提高，说明外源喷施EBR能有效缓解Pb胁迫对番茄幼苗的伤害，提高番茄对Pb胁迫的抗性，有利于提高番茄产量品质，对农业生产具有重要意义。