HPLC法同时测定清火抗毒丸中三种成分的含量

郭慧青 赵 颖 高振东 张旭东 顾艳丽* 徐佳璐 谢宇鑫

1.内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特 010110；2.内蒙古自治区巴彦淖尔市残联眼科医院，内蒙古 巴彦淖尔 015000

清火抗毒丸是巴彦淖尔市眼科医院中医医师常用且效果良好的内服组方，由栀子、龙胆、黄芩、黄连和黄柏等十三味药组成，具有抗菌、抗炎、解毒、清热等功效，适用于角膜炎、细菌性或病毒性结膜炎、睑板腺感染及化脓性泪腺炎等眼睑及眼眶炎症疾病的治疗。方中龙胆能够杀毒抑菌、泻肝胆实火，可以治疗肝火过盛引起的目赤目肿目痛。其主要成分为龙胆苦苷，龙胆苦苷主要通过抑制多种炎症介质的释放起到抗炎镇痛的作用[1]。栀子能用于清热泻火、凉血消肿解毒,可广泛应用于治疗因血热导致的急性鼻出血、眼肿痛。栀子苷是栀子的主要成分，栀子苷抗炎、镇静、降压、解热作用突出[2]。黄芩主要有效成分为黄芩苷，黄芩苷有明显抗菌作用[3]，机制有二：一是能有效的抑制细菌新的生物膜合成，致其繁殖减慢；二是使细菌生物膜的渗透性增加利于抗菌药物进入。黄芩苷、龙胆苦苷和栀子苷三种成分共同具有抗炎解毒作用，为本方治疗眼部炎症及感染的主要有效成分，含量测定选择同时测定这三种成分,不仅操作简单、结果准确可靠，最重要的是能为本药药效是否良好提供标准，保证药品质量。本实验使用的高效液相色谱法具备操作自动简便、检测灵敏、分离效率高和分离速度快等优点，在生药、复方中药等复杂体系的成分分离分析中发挥重要作用。复方中药中多指标的同时测定能直接反映药品的质量的同时还能够减少分析的成本，提升分析的准确度。该制剂目前已完成前期成型工艺，为提高药品的质量控制要求，本实验从主要成分的含量测定方面进行研究，拟制定清火抗毒丸的质量标准。

1 仪器与材料

1.1 仪器 真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)、SB25-12DTD超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，高效液相色谱仪Dionex Ultimate 3000(赛默飞世尔科技有限公司)，AR224CZ万分之一电子天平(奥豪斯仪器上海有限公司)。

1.2 材料 黄芩苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110726-201706)；龙胆苦苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110770-201716)；栀子苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110749-201718)。清火抗毒丸(巴彦淖尔市残联眼科医院提供，批号20190103、20190105、20190107),经内蒙古医科大学中药学渠弼教授鉴定。甲醇为色谱纯,水为超纯水,其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：ODS-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-0.1%磷酸水溶液；柱温：30℃；流速：1 mL·min-1；波长：254 nm。以下专属性、线性关系、精密度、稳定性、重复性、加样回收实验均使用此色谱条件。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

2.2 混合对照品溶液的制备 精密称取黄芩苷、龙胆苦苷和栀子苷对照品适量溶于色谱甲醇，定容即得混标溶液，其每1 mL对照品溶液中包括黄芩苷、龙胆苦苷、栀子苷分别为55 μg、44 μg和86 μg。

2.3 供试品溶液的制备 精密称定0.2 g清火抗毒丸粉末于锥形瓶中，加甲醇25 mL，精密称定锥形瓶,密塞，超声处理(250 W,40 kHz)30 min，放冷，重新称定其重量,甲醇补足缺失重量，摇匀并滤过，取续滤液，续滤液用0.45 μm的微孔滤膜滤过，即得供试品溶液[4]。

2.4 阴性对照溶液的制备 将本方各个药材粉碎过筛，全方分别除去龙胆,栀子和黄芩按各自处方比混合，根据“2.3”项方法制备阴性对照溶液。

2.5 专属性试验 取“2.2”、“2.3”、“2.4”项下溶液各10μL进样,相同保留时间下，供试品溶液在龙胆苦苷、栀子苷、黄芩苷相应位置有色谱峰,阴性对照溶液相同位置未见干扰,表明该方法具有专属性良好,结果如图2所示。

A.混合对照品溶液；B.供试品溶液；C.缺龙胆样品溶液；D.缺栀子样品溶液；E.缺黄芩样品溶液；1.龙胆苦苷A；2.栀子苷；3.黄芩苷图2 清火抗毒丸高效液相色谱图

2.6 线性关系考察 分别精密吸取“2.2”项下溶液0.5、1、2、4、5 mL置5 mL容量瓶中，甲醇定容并摇匀，测定线性关系。以峰面积(Y)为纵坐标，对照品浓度(X，mg·mL-1) 为横坐标，作图，分别得出龙胆苦苷的线性方程：Y=143.02X+0.0742(r=0.9999),栀子苷线性方程：Y=157.72X-0.0081(r=1),黄芩苷线性方程：Y=235.99X+0.4012 (r=0.9998)。龙胆苦苷在8.6～86 μg·mL-1、栀子苷在4.4～44 μg·mL-1、黄芩苷在 5.5～55 μg·mL-1与峰面积的线性关系良好。

2.7 精密度试验 取“2.2”项下溶液，进样6次，每次10 μL，记录峰面积。龙胆苦苷、栀子苷以及黄芩苷对照品的峰面积RSD依次为0.16%、0.08%和0.13%(n=6),结果显示该仪器精密度良好[5]。

2.8 稳定性试验 取同批次样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在0、2、4、6、8、10、12、24 h分别进样，记录各峰面积，龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷峰面积的RSD依次为0.66%,1.97%,0.47%(n=6)。表明样品溶液放置24 h各成分含量稳定。

2.9 重复性试验 选同批次样品(批号：20190103)，按“2.3”项下方法制备6份供试品溶液，测定各峰面积，结果显示龙胆苦苷、栀子苷以及黄芩苷峰面积的RSD 分别为1.0%、1.4%、1.5%(n=6)，表明该方法重复性良好。

2.10 加样回收试验 取同批样品6份(批号：20190103)，精密称定，每份约0.1 g，分别加入龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷对照品溶液1 mL(浓度依次为6.5、8、24.5 μg·mL-1)，测定峰面积，各成分平均加样回收率分别为101.24%、98.64%、99.38%，RSD分别为1.06%、1.04%、0.45%(n=6)。

2.11 样品含量测定 取3个批次的样品(批号：20190103、20190105、20190107)，按照“2.3”项方法，制备供试品溶液平行样3份，测定每批样品中龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷的含量，结果见表2。

表2 三批清火抗毒丸样品含量测定结果 (n=3，mg·g-1)

3 讨论

3.1 选择测定波长 紫外-可见分光光度仪测定结果显示：龙胆苦苷、栀子苷、黄芩苷的最大吸收波长分别是270 nm、242 nm、276 nm。改变波长进样后，发现254 nm处同时测定含量时，各峰的分离度较好，基线较平，峰面积较大，所以选择在254 nm下对三种成分进行含量测定[6-8]。

3.2 流动相的选择 用甲醇-0.1%磷酸水溶液和乙腈-0.1%磷酸水溶液作为两种待选流动相,当选用乙腈-0.1%磷酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱时，出峰时间较早，而且龙胆苦苷峰和栀子苷峰不能实现良好分离，并且基线不平稳；当采用甲醇-0.1%磷酸水溶液系统进行梯度洗脱时，此条件下各峰分离很好，而且均符合药典的要求，因此选择甲醇-0.1%磷酸水溶液作为流动相。

3.3 提取溶剂和方法 首先对50%甲醇、70%甲醇和甲醇三种提取溶剂进行考察，使用甲醇作提取溶剂时，提取出的供试品溶液中三种成分的综合提取率最佳；采用不同时长超声(15、30、60 min)处理时，发现超声处理30 min和60 min的供试品溶液中三种成分的提取率无明显差异，其中超声15 min时的提取率较低，因此选择超声30 min提取，操作简便且能量消耗少。

本实验通过综合考量测定波长、色谱条件、提取工艺等可能影响含量检定的各类因素，筛选出适合同时测定三种成分的HPLC法，结果准确可靠,此法可作为清火抗毒丸的质量控制指标。

4 小结与展望

随着现代检测分析方法如高效液相色谱的不断发展，复方中药的研究也逐渐深入，分离、测定中药有效成分，阐明中药作用机理等工作正有序开展，并取得了可观成果。复方中药发挥药效时通常是多种有效成分共同协作，可能是一味药增强另一味药的治疗作用，或者是一味药消除其他味药的副作用，单独测定一种主要有效成分通常不能很好控制复方药的质量。因此在复方中药的质量控制中多指标成分的分离与测定具有特别重要的意义。在同一方剂中，复方中药的体内药物动力学特征以及复方药效受药材中指标成分影响，而配伍药材的比例与其各自含量又显著影响指标成分的高低[9]。因此复方中药配伍以后，各指标成分的比例、含量不仅仅能够反映药物制剂的工艺水平，更重要的是能够表征和确保复方中药(及其制剂)的药物疗效。清火抗毒丸是民间应用广泛的复方中药，其治疗如上所述眼科疾病疗效确切，但因其处方复杂，有效成分尚待分离确定，导致本药生产过程中的质控环节难以规范。本实验建立HPLC法同时测定清火抗毒丸龙胆苦苷、栀子苷、黄芩苷的含量, 通过方法学验证,本实验所建立的方法不仅简单，而且可靠,此法用于清火抗毒丸的质量控制将给制备和检测工作带来极大便利。清火抗毒丸仍有许多辅助发挥药效的有效成分未被分离发掘，建立适当分析方法来测定其他重要组分，并详细研究其作用靶点、机制通路都将是后续研究的方向。