MAPK通路在幽门螺旋杆菌OipA诱导表达IL-8中的作用机制

梁怀盼，陈璐

（南京市浦口区中心医院 检验科，江苏 南京）

0 引言

目前，胃癌仍为我国常见的癌症，致死率排名前五位。经各国科学家的研究发现，幽门螺旋杆菌有许多毒力因子，其中CagA、VacA、OipA等为其主要的致病因子[1]。OipA是一种幽门螺杆菌外膜蛋白基因，编码相对分子量为34 kD，基因位置HP0638，其编码产物称为前炎症蛋白OipA[2]，可在90%以上胃溃疡和胃癌患者的病变组织中检测到OipA蛋白，开放性的OipA与中性粒细胞的浸润程度以及胃粘膜高水表达IL-8密切相关[3-4]。因此，我们来研究OipA通过何种信号通路，释放细胞因子IL-8，进一步研究OipA蛋白调控下游因子释放IL-8的分子机制。

1 材料和方法

1.1 材料

细胞为人胃黏膜上皮细胞株GES-1，江苏大学教研室保存。OipA融合蛋白由江苏大学教研室王华博士馈赠。高糖DMEM培养基、胰蛋白酶（EDTA）购自上海通善公司；RPMI-1640购自镇江易贝生物公司；RT-PCR Kit购自TOYOBO公司；RNA提取试剂盒购自Fastgen公司；DEPC水、LPS购自TakaRa公司；DMSO（二甲亚枫）购自Sigma公司。P-38、P-ERK、ERK、抗体购自美国Cell signaling公司。特异性抑制剂PD98059和SB203580购自美国Sigma公司。

1.2 方法

（1）细胞培养，GES-1细胞用含100%小牛血清的高糖DMEM培养液培养。经37 ℃，5% CO2，95%湿度环境培养，当细胞生长达到80%融合时，用0.25% EDTA消化传代。

（2）将GES-1细胞消化、重悬、计数，稀释至1×106/mL的浓度转种于细胞培养皿，当细胞生长基本融合时，加入蛋白终浓度分别为 1、10、20、40、80 µg/mL 目的蛋白 OipA，经培养4 h后，离心5 min，1000 rpm，4 ℃，收集细胞。提取细胞总RNA，用LPS做阳性对照，以未处理组为阴性对照。

（3）逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测IL-8 mRNA的表达各组取10 μg总RNA，将其逆转录成cDNA，总体系20 μL，42 ℃ 20 min，99 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min cDNA 产物于-80 ℃保存备用。GADPH和IL-8引物均由上海生工生物工程公司合成，见表1。PCR扩增参数为：94 ℃ 预变性5 min；94 ℃ 30 s、59 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s，30 个循环后；72 ℃再延伸10 min。最后经琼脂糖凝胶电泳跑胶、EB染色、Genius凝胶电泳图象分析系统分析并鉴定。

表1 RT-PCR应用的PCR引物

（4）信号通路抑制试验，为进一步验证OipA是否通过MAPK信号通路，来影响炎症因子IL-8的表达。待GES-1细胞贴壁后，先用50 μm SB203580和PD98059预处理1 h，然后再加入终浓度为80 μg/mL OipA继续培养48 h。再检测其IL-8mRNA的表达情况。

（5）Western Blot检测，加入RIPA缓冲液，裂解。取40 g蛋白进行SDS-PAGE电泳，经4 ℃，转至PVDF膜上，在室温下，用封闭液封闭3 h。之后换新封闭液加一抗，经37 ℃摇床反应1 h，于4 ℃过夜。再用1×PBST洗涤3~5次，每次5 min，并将1×PBST中加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，再用37 ℃摇床反应1 h，洗涤3~5次，每次5 min。洗涤完毕后将膜放入显色液中显色，并轻轻振荡显色液。显色后，即刻清洗，待膜自然干燥，扫描照像并保存。

2 结果

2.1 OipA对细胞表达IL-8mRNA的影响

经不同浓度的OipA融合蛋白作用于GES-1细胞，经4 h后，提取细胞总RNA，进行检测IL-8。阴性对照组未检测到IL-8 mRNA表达，而阳性对照LPS和OipA蛋白作用后，4 h时即可检测到IL-8 mRNA的表达。低浓度组未检测到，而随着浓度的增加IL-8 mRNA的表达越多，呈浓度依赖性。

2.2 MAPK信号通路对IL-8表达的影响

MAPK通路在肿瘤的发生发展中具有重要的地位。因此，我们用信号通路抑制剂SB203580和PD98059来检测MAPK信号通路在OipA释放细胞因子IL-8中的作用。我们用SB203580检测P-38/MAPK信号通路。预处理GES-1细胞1 h后，来检测IL-8 mRNA表达情况。同样的方法用PD98059来检测ERK/MAPK信号通路。经研究发现，应用信号抑制剂后，IL-8 mRNA的表达没有明显差异。

2.3 OipA对MAPK信号通路的影响

将80 μg/mLOipA蛋白作用于GES-1细胞后，检测P-38和P-ERK 的表达。发现OipA可以使P-38和ERK磷酸化，上调其表达。因此，OipA可通过MAPK信号通路释放IL-8。

3 讨论

近年来，前炎症蛋白（Outer Imflammatory Protein）及其表达产物OipA在胃癌发生、发展中的意义逐渐引起国内外学者的关注。OipA是幽门螺杆菌中一种编码相对分子量为34 kD的外膜蛋白基因，又称HopH，其是基因位置HP0638编码产物，又称为前炎症蛋白OipA。外国专家Yamaoka[5]发现在CagA表达阴性的情况下，HP0638阳性的菌株诱导IL-8的能力比HP0638阴性的菌株强3倍。在对于信号转导通路的研究中发现，完全激活IL-8启动子，OipA和CagA是必备条件。但是OipA的作用更为重要，并与IL-8的表达水平呈正相关[6]。本实验发现OipA参与IL-8的表达，并且呈剂量依赖性的。IL-8的产生而促进细胞增殖的同时，与NO等炎症因子诱导细胞凋亡。在胃癌病变前期，增殖和凋亡可处于相对平衡状态，而随着幽门螺旋杆菌感染长期持续的感染，血清中IL-8和NO浓度发生了变化，使增殖与凋亡逐渐失衡，最终发展成为胃癌。

目前已有研究证实Hp及其菌体成份，如脂多糖、热休克蛋白60可经激活丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated Protein Kinase, MAPK）启动一系列的转导的级联反应，诱发胃黏膜的增殖反应[7]。然而，OipA促进胃癌细胞增殖的机制目前仍不清楚。在本研究中，我们发现OipA可通过P-38和P-ERK通路的活化介导了其对胃癌细胞的促增殖作用和影响IL-8的表达。这与Yamaoka报道的CagA蛋白可以激活ERKl/2通路促进细胞增殖结果一致[8]。这些结果提示P-38和P-ERK 信号通路在OipA促进胃癌细胞增殖的信号传导中起重要作用。