颈项透明层厚度增厚胎儿应用染色体微阵列技术效果分析及其临床意义

刘 敏 曾 静 曾 云 吴丽芳

1.广东省惠州市第二妇幼保健院妇产科，广东惠州 516008；2.广东省惠州市第二妇幼保健院超声科，广东惠州 516008；3.广东省惠州市第二妇幼保健院分子实验室，广东惠州 516008

颈项透明层（nuchal translucency，NT）是妊娠11～13+6周时超声下显示的胎儿颈后部皮下的液体生理性积聚，是胎儿非整倍体染色体畸形的敏感性指标[1]。目前临床传统的染色体核型分析技术仅能检出非整倍体染色体数目及较大片段（＞10 Mb）的结构异常，在核型分析显示正常的NT增厚胎儿中，仍有少部分胎儿出现各种结构畸形和遗传综合征等不良预后[2]。染色体微阵列技术（chromosome microarray analysis，CMA）相比传统核型分析具有分辨率高，能检出＞100 kb的拷贝数变异（copy number variants，CNVs）的优势[3]。本研究旨在探讨CMA检测在NT增厚胎儿中的应用价值，为临床遗传咨询提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年9月至2020年8月惠州市第二妇幼保健院妊娠早期行超声筛查显示NT≥2.5 mm胎儿203例，均行介入性产前诊断（绒毛/羊水取材术），获取胎儿标本，同时行染色体核型分析及CMA检测。纳入标准：①孕11～13+6周；②单胎妊娠；③均进行遗传咨询并签署知情同意书，排除夫妻双方本身合并染色体异常疾病。本研究获得医院医学伦理委员会批准。依据文献[4]对孕11～13+6周早孕期胎儿超声筛查进行规范化操作及储存图像，测量胎儿NT值3次以上，记录NT最大值，以NT≥2.5 mm定义为异常增厚，并按照不同胎儿NT厚度分为四组，2.5～2.9 mm组、3.0～3.9 mm组、4.0～4.9 mm组及≥5.0 mm组。

1.2 检测方法

1.2.1 样本采集 对NT增厚的胎儿在超声仪（三星麦迪有限公司，型号：WS80A）引导下进行胎儿组织物取材术，并将胎儿组织标本，放置于4℃冰箱中保存待检。

1.2.2 DNA提取 取得胎儿组织物标本后，经规范处理，使用全基因组DNA提取试剂盒（广州硕恒生物科技有限公司，品牌：Qiagen，生产批号：163011552）提取DNA，紫外分光度计（NanoDrop公司，型号：ND-1000）测定所提取DNA的浓度和纯度。

1.2.3 染色体核型分析 取胎儿样本，离心出干净的绒毛标本，接种于培养基瓶中常规培养观察，收获标本进行常规制片，80℃烤6 h，采用G显带，显微镜下观察30个中期分裂相，两线镜下各分析5个染色体核型，嵌合体以加倍计数分析。

1.2.4 CMA检测 根据提供的基因芯片（Affymetrix公司，型号：CYTOSCAN 750k）标准实验操作流程对所提取的全基因组DNA进行处理。具体操作流程是基因组DNA酶切消化、连接、聚合酶链式反应扩增、纯化定量分析、片段化、标记，芯片杂交、洗涤、染色与扫描芯片。根据CMA检测结果参考常用国际公共数据库，如基因变异的数据库（Database of Genomic Variants，DGV）及本实验室内部数据库，对CNVs的性质进行判断。

1.3 观察指标及评价标准

观察传统染色体核型分析及CMA检测NT增厚胎儿合并结构畸形类型及其检出率的差异性，并比较不同NT值分组间采用CMA检测致病性CNVs病例均数。检测结果出现以下情况时均可判断为致病性CNVs：该CNVs片段与DECIPHER数据库中已知的微缺失/微重复综合征区域相重叠；该片段遗传自有相同表型的亲代；临床意义不明确的CNVs（variant s of uncertain significance，VOUS）：已知国际在线数据库（如DGV，DECIPHER，ISCA等）中未找到重叠片段；片段内含有功能尚不明确的基因。

1.4 统计学方法

应用SPSS 21.0统计软件进行数据统计分析，计数资料用百分比表示，采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 染色体核型分析及CMA检测结果比较

传统核型分析检出染色体异常70例（34.98%），CMA检测发现77例染色体异常，检出率为37.93%，且额外检出致病性CNVs共7例，见表1。

表1 染色体核型分析及CMA检测结果比较（n=203）

2.2 不同NT值分组CMA检测结果分析

2.5～2.9 mm组共检出6例（16.22%）异常；3.0～3.9 mm组共检出17例（22.67%）异常，其中2例致病性CNVs；4.0～4.9 mm组共检出19例（40.43%）异常，其中2例致病性CNVs；≥5.0 mm组共检出35例（79.55%）异常，其中1例致病性CNVs，2例为VOUS。另外，随着NT值的增加，胎儿染色体异常发生率也随之增加，差异有统计学意义（χ2=47.322，P=0.000），见表 2。

表2 不同NT值分组CMA检测结果分析

2.3 7例核型分析正常而CMA检测异常结果分析

7例染色体核型正常的胎儿经CMA检测检出的CNVs具有致病性，其中4例有微缺失综合征，3例微重复综合征，与传统染色体核型分析检测结果比较，CMA检测的检出率提高了3.45%（7/203），见表3。

表3 7例核型分析正常而CMA检测异常结果分析

3 讨论

染色体异常通常指染色体的数目及结构异常，是导致胎儿出生缺陷的主要原因，且其除了伴发多系统畸形外和智力障碍外，致残率及致死率均高，给社会和家庭带来了极大的精神和经济负担[5-6]。随着临床技术的研究发展，CMA因其具有提高染色体检出率显著优势被广泛应用于产前诊断中，CMA对NT增厚但染色体正常的胎儿进行CNVs判断，所获得具有临床意义的染色体微缺失/微重复检出率达7.7%～8.3%[7]。

本研究对孕早期NT增厚的胎儿进行传统的染色体核型分析，染色体异常的检出率为34.98%，主要包括染色体数目异常及少部分结构畸变等。但对NT增厚胎儿进一步行CMA检测，额外检出7例致病性染色体异常。在核型分析显示染色体正常的胎儿中，可能隐藏着亚显微结构的基因突变或基因CNVs，这往往与染色体微结构异常或遗传综合征相关[8]。而CMA针对产前超声检查发现胎儿结构异常的情况的检测具有显著诊断作用，其能够检测出传统染色体核型分析无法检测的CNVs和单亲二倍体等[9]。关于NT值与胎儿CNVs的相关性，刘伟明[10]的研究显示，随着NT厚度的增加，CNVs发生率也随之增高。在本研究中，不同NT值分组间CMA检测染色体异常的发生率也明显升高，因此认为NT增厚胎儿与胎儿染色体异常的发生率呈明显的正相关。此外，本研究通过CMA额外检出7例染色体微缺失/微重复，其片段大小介于 0.256 ～3.181 Mb，其中6例为致病性CNV，2例为VOUS。在不同NT值组中，CMA的检出率高于传统核型分析的3.45%，主要由于CMA可检测传统核型分析难以识别的亚显微结构异常[11-12]。CMA作为最常用的临床遗传学诊断工具之一，在产前诊断的应用中，相比较于传统的核型分析，其具有不可替代的重要性[13]。CMA的特点是在全基因组范围内高分辨检测，尤其针对染色体的CNVs可进行精准检测，可检出传统染色体核型分析所发现大部分异常及较小片段的微缺失/微重复，具有高分辨率、高通量、高自动化检测的优势[14-15]。CMA技术在NT增厚的应用中，能够检出更多具有临床意义的致病性疾病，在产前诊断标准检测中具有可行性的重要意义。

综上，胎儿NT增厚与染色体异常密切相关，CMA技术能检测传统核型分析无法识别的染色体微缺失/微重复，提高染色体疾病的检出率，为产前诊断和遗传咨询指导提供依据。