不同嫩度青砖茶改善小鼠胃肠道功能研究

苏 丹，唐 飞，张善明，陈玉琼，倪德江

（华中农业大学园艺林学学院/农业农村部华中都市农业重点实验室，武汉 430070）

由于受饮食规律、饮食结构、社会因素及心理因素的影响，越来越多人患有胃肠健康相关的疾病。胃肠道的健康尤其是肠道菌群的平衡影响机体营养物质的吸收、能量供应、机体免疫等功能的运行，是影响人体健康的重要因素［1，2］。治疗胃肠疾病的药物虽然有一定的特效性，但长期服用易产生依赖性、抗药性以及对肝脏易产生副作用等问题，因此寻求安全、有效、天然的“胃肠调节剂”是预防和治疗相关疾病的新途径。

青砖茶属于六大基本茶类之一的黑茶，为后发酵茶，原产于湖北省赤壁市羊楼洞，历史悠久，源于唐，盛于明清［3］。晒青毛茶经渥堆发酵、干燥、再拼配、蒸压成型、低温长烘、陈化等工序加工成为青砖茶，优质的青砖茶香气纯正，有木香或菌香，滋味醇和，汤色红（黄）橙明亮，叶底青褐［4］。青砖茶不仅可以生津解渴、利尿解毒、消臭除菌，还具有减脂、降血脂、抗氧化、改善肠道功能等生理功效［5-7］。长期饮用青砖茶可以一定程度上预防胃肠疾病。然而，由于茶树对氟的吸收特性，茶叶的含氟量随成熟度的增加而增加，以成熟新梢为原材料的青砖茶含氟量往往超过国家标准（0.3‰），高的达到0.8‰以上［8-10］，而长期多量饮用含氟量高的茶叶易导致人体内氟元素过量而引发氟斑牙、氟骨症等疾病［11］。研究表明，除选用低氟茶树品种［12］、改善栽培条件、改变加工方式［13］等方法外，还可以通过降低原料的成熟度［14］来降低青砖茶的含氟量，但有关青砖茶嫩度提高后是否影响其功能的研究较少。

改善肠道功能是青砖茶最为重要的活性之一。前期已经就不同年份青砖茶［15］、不同发酵程度青砖茶［16］对小鼠胃肠道功能的改善作用进行了研究，但仍缺乏不同嫩度青砖茶对改善胃肠道功能的研究。因此，本研究通过测定小鼠胃排空率和小肠推进率以及肠道菌群数量，研究了不同嫩度青砖茶对小鼠胃排空及小肠推动功能和肠道菌群的作用，并分析了青砖茶的生化成分与胃肠道功能的相关性，以探明嫩度对青砖茶改善肠道功能的影响，为创新青砖茶原料采收技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品

恩施州宣恩县伍台昌臣茶业有限公司生产的晒青毛茶，嫩度为纯单芽、一芽二三叶、一芽四五叶。渥堆试验在人工气候箱（RXZ-328A型）进行，掌握渥堆叶含水量38%、温度45℃、湿度85%、渥堆时间18 d。渥堆结束后在SKFG-01型电热恒温鼓风干燥箱中烘干，得到单芽、一芽二三叶、一芽四五叶不同嫩度的青砖茶原料。

1.2 试验动物

健康成年昆明种小鼠，体重（25±1）g，SPF级，由湖北省实验动物研究中心提供，许可证号：SCXK（鄂）2015-0018。

1.3 药品及试剂

营养性半固体糊的制备：10 g羧甲基纤维素钠加16 g奶粉、8 g蔗糖、8 g淀粉、5 g活性炭溶解于250 mL蒸馏水中搅拌均匀制成300 mL（约300 g）半固体糊状物，冰箱冷藏，使用前2 h取出，恢复至室温。肠道菌群培养基及厂家如表1所示。

表1 肠道菌群培养基及厂家

1.4 主要设备

AW220型电子分析天平、RXZ-328A型人工气候箱、SKFG-01型鼓风干燥箱、巨轮牌FZ102型植物粉碎机、SW-CJ-2FD型超净工作台、HH-6型数显恒温水浴锅、DNP系列电热恒温培养箱、厌氧盒、高压灭菌锅、常规玻璃仪器等。

1.5 方法

1.5.1 不同嫩度青砖茶水提物的主要化学成分测定 茶多酚总量采用福林酚法［17］，儿茶素组分、咖啡碱、有机酸含量采用高效液相色谱法（HPLC），氨基酸总量检测采用茚三酮显色法［18］，水浸出物含量采用重量法［19］，可溶性糖含量采用蒽酮比色法［20］，茶黄素、茶红素和茶褐素含量采用系统法［21，22］。所有试验重复3次。

儿茶素组分及咖啡碱含量检测的HPLC条件：用70%甲醇溶解在70℃水浴中浸提样品10 min，3 000 r/min离心10 min，过0.45 μm滤膜后待测。HPLC条件：LC1200，Agilent，USA；色谱柱，Agilent TC-C18（4.6 μm×250 mm）；进样量5 μL；流速1 mL/min；温度35℃；检测波长280 nm；流动相A，超纯水（0.1%甲酸）；流动相B，甲醇（0.1%甲酸）；梯度洗脱条件，0～10 min，100% A；10～20 min，68% A和32% B；20～30 min，100%A。

有机酸组分含量检测的HPLC条件：用蒸馏水在100℃水浴中浸提20 min，脱脂棉过滤，用微孔滤膜过滤。色谱柱：AgilentHB-C18，色谱条件：柱温30℃；流速0.4 mL/min；进样量10 μL；检测波长：210 nm；流动相A：KH2PO4，流动相B：甲醇；梯度洗脱条件，0～5 min，99% A，1%B；5～25 min，97%A，3%B；25～30 min，99%A，1%B。

1.5.2 青砖茶水提物的制备 取青砖茶茶粉，以茶水比1∶15微沸提取30 min，抽滤，旋转蒸发浓缩，分别配制成不同嫩度青砖茶茶汤。

1.5.3 青砖茶水提物剂量的选择 参考黑茶吸收试验，人体推荐量为每人10 g/d（成人60 kg），试验设计剂量为人体推荐量的10倍（1 667 mg/kg）［23］，另设正常对照组给予等体积蒸馏水。

1.5.4 不同嫩度青砖茶对正常小鼠胃排空和小肠推进功能的影响 小鼠适应饲养4 d后，开始正式试验。取健康小鼠40只，全为雄性，随机分为正常对照组、单芽组、一芽二三叶组、一芽四五叶组，每组10只。每组按每只0.15 mL/10 g分别灌胃，1次/d，青砖茶水提物连续给15 d；正常对照组灌胃等体积的蒸馏水。末次灌胃前24 h，小鼠禁食不禁水。第15天给予青砖茶水提物后30 min，每只小鼠灌胃5%的炭末混悬液（用l%的羧甲基纤维素钠配制）0.8 mL。灌营养性半固体糊25 min后，小鼠脱颈椎处死，取胃，滤纸拭干后称全重，沿胃大弯剪开胃体，洗去胃内容物后拭干称胃净重。胃全重和胃净重的差值为胃残留物重，以此与所灌半固体糊的重量百分比为胃内残留率（%）。迅速取出小鼠的胃及回盲肠部位的整段小肠，剪取上端自幽门、下端至回盲部的肠管，轻轻剥离后不加牵引直铺于白纸上，铺直后测量幽门至炭末前沿的距离，以幽门至炭末前沿的距离占幽门至回盲部全长的百分率为炭末推进百分率（%）。

胃内容物残留率=（胃全重-胃净重）/半固体糊重×100%

炭末推进百分率=（炭末移动距离/肠总长度）×100%

1.5.5 不同嫩度青砖茶对正常小鼠肠道菌群的影响 无菌采集小鼠新鲜粪便0.1～0.4 g，置于己称重的干燥灭菌小试管（编号为10-1）中，充分振荡，直至粪便分散均匀，再依次10倍稀释至10-9，4 h内完成。根据预试验结果，选择合适的稀释度，分别取1 mL接种到各类选择性培养基上，3个重复。EMB培养基和胆汁七叶苷叠氮钠琼脂培养基放入37℃需氧培 养24～48 h后 计 数，BBL培 养 基 及MRS培 养 基37℃厌氧培养24～48 h后计数。根据菌落形态，涂片分析计算各菌群每克粪便中菌落形成数，结果以对数表示（lgCFU/g）。

1.6 数据分析

试验数据用Excel 2010和SPSS 18.0软件统计处理分析。SPSS 18.0试验数据用（x±s）表示，采用单因素方差分析，组间用两两比较差异法，同列不同大小写字母分别表示在0.01、0.05水平差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同嫩度青砖茶主要品质成分测定结果

青砖茶主要生化成分含量因毛茶原料的嫩度不同而具有一定的差异。由表2可知，单芽青砖茶的游离氨基酸含量、茶多酚含量最高，与一芽二三叶、一芽四五叶青砖茶存在极显著差异（P＜0.01），而其茶褐素含量与一芽四五叶青砖茶差异极显著（P＜0.01），与一芽二三叶青砖茶无显著差异。一芽二三叶青砖茶的可溶性糖、水浸出物、茶黄素、茶红素含量最高，极显著高于单芽青砖茶和一芽四五叶青砖茶（P＜0.01）。

表2 不同嫩度青砖茶水提物的主要化学成分测定结果

由表3可知，儿茶素组分和咖啡碱含量在不同嫩度青砖茶中均存在差异。在3种不同嫩度青砖茶中均未检出GC和GCG，在一芽四五叶青砖茶中均未检出C、ECG、EC，在单芽青砖茶中未检出CG。一芽二三叶青砖茶的EGCG、C、ECG、EC含量均高于单芽青砖茶和一芽四五叶青砖茶，而一芽四五叶青砖茶的CG含量高于一芽二三叶青砖茶。随青砖茶原料成熟度增加，EGC含量极显著增加，咖啡碱含量极显著减少。

表3 不同嫩度青砖茶儿茶素和咖啡碱含量测定结果 （单位：mg/g）

由表4可知，有机酸组分及其含量在不同嫩度的青砖茶中均存在差异。在3种不同嫩度青砖茶中均未检出酒石酸、α-酮戊二酸、乙酸，在一芽四五叶青砖茶中富马酸、琥珀酸也未检出。单芽青砖茶的奎宁酸、乳酸、柠檬酸、没食子酸、富马酸含量最高，且前4种有机酸含量与其他嫩度青砖茶具有极显著差异（P＜0.01），一芽二三叶青砖茶的草酸、琥珀酸含量最高，一芽四五叶青砖茶的苹果酸含量最高。

表4 不同嫩度青砖茶有机酸组分含量测定结果 （单位：mg/g）

2.2 不同嫩度青砖茶水提物对小鼠胃排空的影响

由表5可见，在给予小鼠连续灌胃不同嫩度青砖茶水提物15 d后，小鼠的胃排空能力发生了明显变化。与正常对照组比较，单芽组、一芽二三叶组和一芽四五叶组胃内容残留率分别减少了26.37%、23.02%、9.58%。从不同嫩度组间差异来看，单芽组与一芽二三叶组差异不显著，与一芽四五叶青砖茶差异显著（P＜0.05），而空白对照组和一芽四五叶组差异不显著。结果表明，不同嫩度青砖茶均能降低胃残留率，促进小鼠胃排空作用，以单芽青砖茶的效果最佳。

表5 不同嫩度青砖茶水提物对小鼠胃排空的影响

2.3 不同嫩度青砖茶水提物对小鼠小肠推进的影响

由表6可见，在给予小鼠连续灌胃不同嫩度青砖茶水提物15 d后，小鼠的小肠推进能力发生了明显变化。与空白对照组相比较，单芽组、一芽二三叶组、一芽四五叶组小肠推进率均显著提高，分别提高了56.73%、37.47%、30.72%。从不同嫩度组间差异来看，单芽组与一芽二三叶组、一芽四五叶组有显著性差异，而一芽二三叶组和一芽四五叶组无明显差异。结果表明，单芽、一芽二三叶、一芽四五叶青砖茶均能提高小肠推进率，显著促进小肠的蠕动作用，且以单芽青砖茶效果最好。

表6 不同嫩度青砖茶水提物对小鼠小肠推进的影响

2.4 不同嫩度青砖茶调节小鼠肠道菌群作用的影响

由表7可见，在连续给予小鼠不同嫩度青砖茶15 d后，小鼠肠道内的肠杆菌、肠球菌、乳杆菌、双歧杆菌数量均发生了明显变化。与空白对照组相比，单芽、一芽二三叶、一芽四五叶青砖茶均对小鼠肠道内肠杆菌、肠球菌的生长繁殖功能有明显的抑制作用，对小鼠肠道内乳杆菌、双歧杆菌的生长繁殖功能有显著的促进作用，且两种作用均以单芽青砖茶的效果最好。

表7 不同嫩度青砖茶对小鼠肠道菌群数量的影响 （单位：lgCFU/g）

2.5 不同嫩度青砖茶主要理化成分与小鼠胃肠道功能相关性分析

如表8所示，小鼠胃残留率、肠杆菌、肠球菌与不同嫩度青砖茶游离氨基酸、茶多酚、茶褐素、咖啡碱、奎宁酸、乳酸、柠檬酸、没食子酸、有机酸总量极显著负相关，而与苹果酸、EGC显著正相关；小鼠小肠推进率、乳杆菌、双歧杆菌与不同嫩度青砖茶氨基酸、茶多酚、茶褐素、咖啡碱、奎宁酸、乳酸、柠檬酸、没食子酸极显著正相关，与苹果酸、EGC显著负相关；可溶性糖、水浸出物、茶黄素、茶红素、茶褐素、EGCG、儿茶素总量、草酸等与小鼠胃肠道功能各指标参数均无相关性。

表8 不同嫩度青砖茶主要理化成分与小鼠胃肠道功能相关性分析

3 讨论

人类消化系统中含有庞大的正常菌群，菌群的组成十分复杂，有高达1 000多种不同类型的细菌及其他微生物群落。除了常见的胃肠道疾病，受人类肠道微生物菌群的直接或间接影响而发生的疾病有：Ⅱ型糖尿病、动脉硬化、肥胖症、骨质疏松、肿瘤、自身免疫性疾病、神经系统疾病、呼吸系统疾病、精神疾病、癌症等［24］。可见肠道菌群与人体之间的关系错综复杂，贯穿于人体各种生理活动和病理过程，已成为人体不可或缺的一部分，肠道健康深刻影响着人体的健康。青砖茶被证明具有抑制肠道内有害菌的增殖、调节肠道菌群和调整肠道紊乱的作用［2］，可作为天然的胃肠调节剂。

不同嫩度的青砖茶因为生化成分的组成和含量不同，对小鼠胃肠功能的影响也不同。从胃排空、肠推进试验中发现，3种嫩度的青砖茶均能促进胃排空和肠推进，以单芽青砖茶的效果最好；从灌胃小鼠青砖茶水提物前后的四大类微生物菌群变化情况中发现，3种嫩度的青砖茶均能促进有益菌双歧杆菌、乳杆菌的增殖，抑制有害菌肠杆菌和肠球菌的增殖，且以促进双歧杆菌和抑制肠杆菌效果尤为显著，以单芽青砖茶的效果最好，与胃排空试验和小肠推进试验结果基本保持一致。结果表明，青砖茶对小鼠胃肠功能的影响与原料嫩度有关，原料越嫩，改善小鼠胃肠道功能效果越好，以单芽青砖茶效果最好。

青砖茶的生化成分组成与原料嫩度、微生物［2，25］有关，不同的有效成分均会对胃肠功能的调节作用造成影响。李鹏等［26］通过给仔猪饲喂常规日粮（对照组）、添加0.1%磷酸型酸化剂A、0.3%磷酸型酸化剂A、0.1%乳酸型酸化剂B和0.3%乳酸型酸化剂B日粮，测定大肠微生物菌群。结果表明，添加磷酸型酸化剂A和乳酸型酸化剂B都可以显著降低仔猪盲肠大肠杆菌和沙门氏菌的数量（P＜0.05），增加乳酸菌和双歧杆菌的数量（P＜0.05）。吴根梁等［27］将从陈放1年和7年的茯砖茶中提取纯化的茶多酚提取物加入到含有65岁老年人的肠道菌群混合培养基中进行体外静态厌氧培养，测定茶多酚和短链脂肪酸（SCFAs）的含量，并进行肠道菌群的高通量测序，对测序结果进行生物信息学分析，表明7年陈茯砖茶的茶多酚类比1年陈茯砖茶的茶多酚类更有益于改善老年人的肠道菌群结构。结合不同嫩度青砖茶生化结果及其与胃肠功能指标的相关性分析，可以初步推测青砖茶的调理肠胃功能成分可能是游离氨基酸、茶多酚总量、咖啡碱、茶褐素［28］、奎宁酸、乳酸、柠檬酸、没食子酸［29］，还有微生物的参与并起到独特作用。

适当提高原料嫩度不仅不会影响青砖茶改善小鼠胃肠道的功能，而且能降低氟含量。