长期施用沼液对土壤中四环素类及磺胺类抗性基因分布的影响

2021-08-18刘兰英何肖云陈丽华宋永康

福建农业学报 2021年6期

刘兰英，黄薇，吕新，何肖云，陈丽华，宋永康

（福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所/福建省农产品质量安全重点实验室，福建福州 350003）

0 引言

【研究意义】沼液中含有丰富的营养元素、氨基酸、B 族维生素和植物生长素等生理活性物质[1]，将沼液作为有机肥料施用于农业土壤，可以为作物生长提供充足的养分需求，同时也是处理畜禽养殖废弃物的主要途径之一。但畜禽养殖过程投入的大量抗生素只有少部分被动物吸收，大部分最终会残留在沼液中，而随着沼液的还田利用，部分抗生素也随之进入土壤环境中[2]。土壤中抗生素的积累可能会诱导微生物产生抗生素抗性基因（Antibiotic resistance genes,ARGs），造成ARGs 的传播扩散[3]。研究表明，ARGs 能在环境中持久性残留，其污染风险可能要比抗生素本身的风险更大[4]。因此，研究沼液施用到土壤后对土壤ARGs 的影响，对于进一步评估沼液还田的安全性具有很重要的意义。【前人研究进展】目前，关于粪肥施用对农田土壤中ARGs 影响的报道较多。Peng 等[5]发现长期的猪粪施用显著增加了土壤中ARGs 的多样性，猪粪处理的土壤比施用牛粪土壤含有更丰富的ARGs。Li 等[6]发现长期的牛粪和鸡粪施用均显著增加了温室土壤中抗生素和ARGs 的残留水平，抗生素浓度与ARGs 丰度显著正相关。Zhao 等[7]发现长期的鸡粪施用显著提高了农田土壤中ARGs 的丰度水平。McKinney 等[8]发现牛粪的施用显著增加了土壤中ARGs 的丰度，且ARGs 丰度会随土壤施肥量增加而增加。【本研究切入点】然而，在众多研究中，对于沼液施用对土壤中ARGs的影响及其季节变化方面的研究较少。唐鹏[2]报道了沼液施用对橡胶人工林土壤抗生素残留的影响，但并未涉及ARGs 方面的研究。【拟解决的关键问题】本研究选取养猪场周边长期施用沼液的土壤为研究对象，同时采集当地未施用过沼液的土壤作为对照，采用荧光定量PCR 方法，对土壤中常见的14 种四环素类ARGs（tetA、tetB、tetC、tetG、tetH、tetK、tetM、tetO、tetQ、tetS、tetT、tetW、tetY、tetZ）和3 种磺胺类ARGs（sul1、sul2、sul3）进行检测，分析长期施用沼液对土壤中ARGs 多样性和丰度的影响，并探讨其季节分布特征，以期为沼液的安全农用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 采样点基本情况

土壤样品采集于建瓯市某养猪场粪污处理沼气工程周边的农田（27°13.30′N，118°12.80′E），已持续施用该养猪场沼液6 年。该养猪场目前生猪存栏数2 500 头，生猪生产区及污水处理区占地面积约6 hm2，猪场污水日排放量约30 m3·d-1。施肥用沼液是由沼气工程充分发酵后经氧化塘处理的液体（沼液与氧化塘的水配比为1∶2）。供试沼液基本理化性质为：pH 7.99，化学需氧量（COD）285 mg·L-1，五日生化需氧量（BOD5）263 mg·L-1，氨氮475 mg·L-1，总氮978 mg·L-1，总磷22.50 mg·L-1。采样点土壤质地为砂壤土，主要种植作物为槟榔芋，每年只种1 季，3 月中下旬种植，11 月初收获，冬季闲田。沼液灌溉的田块按照基肥和追肥方式灌入，在槟榔芋种植前，每667 m2灌入沼液量约15 t，与田土混匀作基肥；随后每隔15 d 进行1 次追肥，每次追肥灌入沼液量约6 t，大概8 月下旬进行最后1 次追肥，整个生长期都不施用其他肥料。其他农艺管理措施均按照当地常规习惯统一实施。

1.2 样品采集与制备

分别于2019 年5 月（春季）、7 月（夏季）、10月（秋季）和2020 年1 月（冬季），在槟榔芋种植地块上进行根际土壤样品的采集，其中春季和夏季的取样时间均为下一次沼液施入的前两天。采样时除去表层枯枝落叶等杂物，用取土器沿着植株的根部采集0～20 cm 土层的土壤样品，标记为BS+，同时采集周边一处地势较高未施用过沼液的槟榔芋土壤作为对照样品，标记为BS-，这两块槟榔芋田同属于一个农户，种植方式和田间管理方式相同。每块样地设置3 份重复，每份重复样品均由五点取样法获得5 个小样组成，现场混合均匀后装入无菌塑封袋中，放入带有冰块的保温箱中运回实验室，-80 ℃冷冻保存待测。

1.3 土壤基因组DNA 提取

采用TIANamp Soil DNA Kit（TIANGEN，北京）试剂盒，参照说明书，对土壤微生物总DNA 进行提取，将提取的DNA 用1% 琼脂糖凝胶进行电泳，使用超微量分光光度计（Quawell Q3000，美国）检测其浓度和纯度。

1.4 土壤ARGs 测定

采用StepOnePlus™ Real-Time PCR System（ABI，美国）实时荧光定量反应平台，对土壤中14 种四环素类ARGs（tetA、tetB、tetC、tetG、tetH、tetK、tetM、tetO、tetQ、tetS、tetT、tetW、tetY、tetZ）、3 种磺胺类ARGs（sul1、sul2、sul3）及16S rRNA 基因进行qPCR 检测和定量分析，其中四环素类ARGs 和16S rRNA 基因所用引物参考Zhu 等[9]，磺胺类sul1和sul2 基因所用引物参考Lu 等[10]，sul3 基因参考Xiong 等[11]。qPCR 扩增体系参照TB Green™ Premix Ex Taq™ II（Takara，日本）试剂盒说明书，10 μL 的qPCR体系包括5.0 μL 的TB Green Premix ExTaqII（Tli RNaseH Plus）（2×），0.4 μL 的上下游引物（10 μmol·L-1），0.2 μL 的ROX Reference Dye（50×），1.0 μL 的DNA 模板，ddH2O 补充体积至10 μL。扩增条件为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，扩增40 个循环。每个样品设3 个平行，以无菌水作为阴性对照，3 个平行均被扩增出来即为有效扩增。

1.5 土壤ARGs 相对丰度计算

选取16S rRNA 基因为参比基因，采用△Ct 方法计算土壤样品中ARGs 的相对丰度，具体计算公式如下[12]：

式中，Ct（ARG）为目标基因的荧光信号达到设定阈值时所需的循环数；Ct（16S rRNA）为参比基因的荧光信号达到设定阈值时所需的循环数；F 值为相对丰度。

1.6 数据分析

采用Microsoft Excel 2007 和SPSS Statistics 13.0软件对数据进行统计分析，并采用Duncan 检验对不同样品进行差异性分析（P＜0.05），柱形图通过OrginPro 2015 软件绘制。

2 结果与分析

2.1 不同季节土壤中ARGs 的多样性

不同季节土壤样品中14 种四环素类ARGs（tet）和3 种磺胺类ARGs（sul）的检测结果如表1 所示。从表1 可以看出，在17 种目标ARGs 中，长期施用沼液的土壤样品中可以检出11～13 种ARGs，其中磺胺类ARGs 的检出率达到100%，检测到的四环素类ARGs 主要包括5 种编码外排泵的基因（tetB、tetG、tetH、tetY、tetZ）和6 种编码核糖体保护蛋白的基因（tetM、tetO、tetQ、tetS、tetT、tetW）。在未施用沼液的土壤样品中检出6～7 种ARGs，磺胺类ARGs 的检出率也达到了100%，但检测到的四环素类ARGs 仅有3～4 种（tetB、tetG、tetY、tetZ）。

表1 不同季节土壤中检测到的抗性基因（n=3）Table 1 Resistance genes detected in the soils in different seasons

长期施用沼液土壤样品中的ARGs 多样性在季节之间波动较明显，4 个季节土壤样品的ARGs 多样性表现为春季＞冬季＞夏季＝秋季，春季明显高于夏季和秋季。未施用沼液土壤样品中一年四季的ARGs多样性变化不大，仅在秋季略有下降。总体而言，长期施用沼液比未施用沼液土壤在各季节均有更高的ARGs 多样性，说明长期施用沼液明显增加了土壤中ARGs 的多样性。

2.2 不同季节土壤中四环素类ARGs 的相对丰度

通过计算不同季节土壤中四环素类ARGs 总和（sumtet）的相对丰度，比较了土壤中四环素类ARGs 的存在水平，结果如图1 所示。

从图1 可以看出，长期施用沼液的土壤中sumtet的相对丰度均在10-4数量级，未施用沼液的土壤中sumtet的相对丰度在10-5～10-4数量级。长期施用沼液土壤中四环素类ARGs 总和的相对丰度，均显著高于未施用沼液土壤中相应ARGs 总和的相对丰度（P＜0.05），表明长期施用沼液会增加土壤中四环素类ARGs 的存在水平。从季节上来看，在长期施用沼液的土壤中，春季四环素类ARGs 总和的相对丰度显著高于其他3 个季节（P＜0.05）。对于未施用沼液的土壤，四环素类ARGs 在春季也呈现出较高的相对丰度。

图1 不同季节土壤中四环素类ARGs 相对丰度总和Fig.1 Sum of relative abundance of tetracycline ARGs in soil specimens collected in different seasons

进一步统计了长期施用沼液和未施用沼液土壤中同时检测到的tetG、tetY 和tetZ 等基因的相对丰度，结果如图2 所示。从图2 可以看出，施用过沼液和未施用过沼液土壤中tetG、tetY 和tetZ 基因的相对丰度分别在10-6～10-4、10-7～10-6和10-6～10-5数量级，表明采集的所有土壤中都有着丰富的tetG和tetZ 基因。与未施用沼液土壤相比，长期施用沼液土壤中tetG 基因的相对丰度基本显著增加，而tetY 基因的相对丰度则显著减少（秋季除外），说明长期施用沼液能够提高土壤中微生物携带tetG 基因的水平。经过连续6 年的沼液施肥，土壤中tetZ 基因的相对丰度与未施用沼液土壤相比无显著差异（P＞0.05），表明该基因的相对丰度没有受到沼液施用的显著影响。从季节上来看，在长期施用沼液的土壤中，tetG 基因在春季土壤中的相对丰度要显著高于其他3 个季节（P＜0.05），而tetY 和tetZ 基因的相对丰度在不同季节之间均无显著差异。对于未施用沼液的土壤，tetG 和tetY 基因在春季也都呈现出较高的相对丰度，而tetZ 基因的相对丰度在不同季节之间无显著差异，表明该基因的相对丰度没有受到季节的显著影响。

图2 不同季节土壤中四环素类ARGs 的相对丰度Fig.2 Relative abundance of tetracycline ARGs in soil specimens collected in different seasons

在长期施用沼液土壤中还检测到tetM、tetO、tetQ、tetS、tetT、tetW 等编码核糖体保护蛋白的基因（图3），其相对丰度在10-7～10-4数量级，这些基因在未施用沼液的土壤中未能检出。从图3 可以看出，在春季和秋季，各基因的相对丰度排序为tetM＞tetW＞tetO＞tetQ＞tetT，tetS 基因未检出；在夏季，各基因的相对丰度排序为tetM＞tetO＞tetW＞tetQ＞tetT，tetS 基因未检出；在冬季，各基因的相对丰度排序为tetM＞tetO＞tetW＞tetQ＞tetS，tetT 基因未检出。可见，tetM、tetO 和tetW 基因在不同季节长期施用沼液土壤中都呈现出较高的相对丰度，其中tetM 基因的相对丰度在10-5～10-4数量级，tetO 和tetW 基因的相对丰度在10-5数量级，说明这3 种核糖体保护蛋白基因在长期施用沼液土壤中的存在水平比其他基因更高。方差分析结果显示，tetM和tetW 基因在春季土壤中的相对丰度要显著高于其他3 个季节，tetO 基因在夏季土壤中的相对丰度要显著高于其他3 个季节（P＜0.05）。

图3 长期施用沼液的土壤中四环素类ARGs 的相对丰度Fig.3 Relative abundance of tetracycline ARGs in soils with long-term application of biogas slurry

2.3 不同季节土壤中磺胺类ARGs 的相对丰度

通过计算不同季节土壤中磺胺类ARGs 总和（sumsul）的相对丰度，比较了土壤中磺胺类ARGs 的存在水平，结果如图4 所示。

图4 不同季节土壤中磺胺类ARGs 相对丰度总和Fig.4 Sum of relative abundance of sulfonamide ARGs in soil specimens collected in different seasons

从图4 可以看出，长期施用沼液的土壤中sumsul的相对丰度在10-4～10-3数量级，未施用沼液的土壤中sumsul的相对丰度在10-5～10-4数量级。长期施用沼液土壤中磺胺类ARGs总和的相对丰度，均显著高于未施用沼液土壤中相应ARGs 总和的相对丰度（P＜0.05），表明长期施用沼液会增加土壤中磺胺类ARGs 的存在水平。从季节上来看，在长期施用沼液的土壤中，磺胺类ARGs 总和的相对丰度呈现春季＞夏季＞秋季＞冬季的趋势，春季的相对丰度显著高于其他季节（P＜0.05）。对于未施用沼液的土壤，磺胺类ARGs 的相对丰度在季节间的波动没有明显的规律，但在春季也呈现出较高的相对丰度。

进一步统计了各土壤样品中不同种磺胺类ARGs的相对丰度，其季节分布特征如图5 所示，可以看出，在分析的3 种磺胺类ARGs 中，sul1 和sul2 基因在各季节土壤中的相对丰度普遍高于sul3 基因，表明采集的所有土壤中都有着丰富的sul1 和sul2 基因。与未施用沼液土壤相比，长期施用沼液土壤中sul1 和sul2 基因的相对丰度都显著增加，这2 种基因在施用沼液土壤中的相对丰度均达到了10-4数量级水平，说明长期施用沼液能够提高土壤中微生物携带sul1 和sul2 基因的水平。从季节上来看，在长期施用沼液的土壤中，sul2 基因在春季土壤中的相对丰度比在其他3 个季节高出1 个数量级，差异达到显著性水平（P＜0.05）；夏季sul3 基因的相对丰度显著高于其他3 个季节。对于未施用沼液的土壤，sul1、sul2 和sul3 基因均在春季土壤中具有更高的相对丰度。

图5 不同季节土壤中磺胺类ARGs 的相对丰度Fig.5 Relative abundance of sulfonamide ARGs in soil specimens collected in different seasons

3 讨论

在ARGs 多样性分析中，发现在未施用沼液的土壤样品中同样能检测到一些ARGs，包括tetB、tetG、tetY、tetZ、sul1、sul2 和sul3，这些ARGs 都存在于长期施用沼液的土壤样品中，说明这些ARGs 在土壤中广泛存在，可能是土壤中的背景ARGs，也可能是污染残留造成的。Knapp 等[13]研究发现在无抗生素污染历史的土壤中就已经存在四环素类、β-内酰胺类和大环内酯类ARGs；Brion 等[14]调查发现，在使用抗生素前的土壤样本中同样能检测到tetC 等四环素类ARGs。Tang 等[15]对稻田土壤的研究也发现不施粪肥土壤中ARGs 的存在。以上研究均表明土壤环境中本身就存在一定浓度的ARGs，这些ARGs可能是由土壤中固有的抗生素抗性微生物所携带的。相关研究表明，土壤中的一些土著微生物为了能够更好地适应环境，自身会产生低浓度的抗生素以抵制竞争者的生存[16]。

分析沼液施用后土壤中ARGs 的变化情况，发现与未施用沼液的土壤相比，长期施用沼液的土壤中具有更高的ARGs 多样性，检测出了7 种后者不具有的ARGs，包括tetH、tetM、tetO、tetQ、tetS、tetT 和tetW，这些ARGs 可能是由沼液带入土壤的外源抗性基因。有研究指出，tetM、tetO、tetQ、tetS、tetT、tetW 等四环素类ARGs 在畜禽粪便中较为常见[17-18]。根据定量分析结果可知，与未施用沼液的土壤相比，长期施用沼液后土壤中四环素类和磺胺类ARGs的总丰度呈显著增加的趋势（P＜0.05），表明长期沼液的施用显著提高了土壤中ARGs 的整体存在水平。这种增加可能是由于沼液提供的养分引起土壤中某些携带四环素类或磺胺类ARGs 微生物的大量繁殖，也有可能是沼液中携带的ARGs 及抗性微生物在土壤中的存活和繁殖引起的。Han 等[19]研究表明，施用动物粪肥通过影响土壤的理化特性，改变土壤中的细菌数量，进而影响土壤中ARGs 的存在水平。大量研究也表明，有机肥的施用会增加农田土壤中ARGs 的多样性和丰度[9,20-21]。然而，本研究发现长期施用沼液土壤中tetY 和sul3 基因在个别季节的相对丰度并没有高于未施用沼液土壤，tetZ 基因受到沼液施用的影响相对较小。这可能与土壤中宿主微生物数量的消长以及基因发生水平转移有关；此外，不同ARGs 之间或许存在互补作用，某一类ARGs 丰度的增加也可能伴随着另一类ARGs 丰度的减少同时发生[22]。

分析不同季节土壤中ARGs 的分布情况，发现在长期施用沼液的土壤中，tetG、tetM、tetQ、tetW 和sul2 等基因的相对丰度具有明显的季节特点，表现出春季的相对丰度要显著高于其他3 个季节（P＜0.05）的趋势，尤其sul2 基因在春季土壤中的相对丰度比在其他3 个季节高出1 个数量级。在未施用沼液的土壤中，检测到的tetG、tetY、sul1、sul2 和sul3 等基因的相对丰度在季节之间波动更明显，但季节之间所呈现出的规律与长期施用沼液土壤相类似，都在春季土壤中具有更高的相对丰度。总体而言，春季各土壤样品中四环素类ARGs 总和与磺胺类ARGs总和的相对丰度均要高于其他季节土壤。这可能是由于春季的气候条件更适合土壤中tetG、sul2 等基因宿主细菌的生存，进而导致四环素类和磺胺类ARGs的总丰度在春季更高。张俊等[23]在研究长期施用四环素残留猪粪的土壤样本中发现，适宜的气候条件对耐药菌及ARGs 的生成具有很好的促进作用，但该研究指出秋季凉爽的气候更适合土壤中ARGs的生成。也有相关研究表明，冬季较低的气温减缓了抗生素在土壤环境中的降解，加上冬季养殖场为预防疫病而加大了抗生素的使用量，导致冬季土壤中ARGs 丰度更高[24]。而本研究发现，除了春季，不同ARGs 在其他季节之间并没有一致的变化规律，关于季节对土壤中不同ARGs 形成的影响机制仍需进一步长期的跟踪调查。

分析土壤中各种目标ARGs 的分布情况，发现四环素类的2 种ARGs（tetG 和tetZ）与磺胺类的2 种ARGs（sul1 和sul2），在不同季节长期施用沼液和未施用沼液土壤样品中都占据较高的比例，属于优势ARGs。此外，tetM、tetO 和tetW 基因也在长期施用沼液的土壤中占据较高的比例，其中tetM 基因达到10-5～10-4数量级水平，tetO 和tetW 基因在10-5数量级水平。楼晨露[24]在研究长期施用猪粪的稻田土壤中发现，磺胺类ARGs 中sul1 和sul2 基因的相对丰度较高，介于10-4～10-3数量级水平，与本研究长期施用沼液土壤中相应基因的丰度水平相当；四环素类ARGs 中tetG 基因的丰度最高，介于10-4～10-3数量级水平，高于本研究（10-5～10-4数量级水平）。彭双等[22]在研究连续施用猪粪的稻麦轮作土壤中也发现，在施用猪粪土壤中tetG 基因的相对丰度最高（接近10-2数量级水平），其次是tetZ 基因（10-3数量级水平），均高于本研究（图2）。相关研究也表明，四环素类ARGs 中tetM、tetO、tetW 基因在养猪场排泄物及周边土壤中大量存在[25]。以上研究表明，四环素类ARGs 中tetG、tetZ、tetM、tetO 和tetW 基因与磺胺类ARGs 中sul1 和sul2 基因在土壤中的传播风险高于其他ARGs，因此养殖场仍需优化发酵工艺以降低粪肥农用带来的ARGs 污染风险。