土壤有机碳分类与测定方法的研究概述①

赵林林 吴志祥 孙 瑞 杨 川 符庆茂 谭正洪

（1 中国热带农业科学院橡胶研究所 海南海口 571101；2 海南大学热带作物学院 海南海口 571101；3 农业农村部儋州热带作物科学观测实验站 海南儋州 571737）

土壤有机碳库是地球陆地生态系统中最重要的碳库之一［1］。土壤在生态系统中扮演着“源”“汇”角色，可精准量化出陆地生态系统的水土保持、水源涵养、固碳释氧、生物多样性保育与可持续发展等功能［2］。全球土壤表层（1 m）总碳量预估为2 100 Pg（1Pg=1015g），其中有机碳库储量约为1 550 Pg，是陆地植被碳库的2~4 倍，大气碳库3倍左右［3］。对土壤的研究经历了从生产功能到生态功能的变化，土壤有机碳的概念也在逐步发展［4］。20 世纪80 年代前，土壤有机碳主要指土壤腐殖质物质，现今土壤有机碳发展至土壤中的动植物残体、腐殖质、微生物及其部分分解产物。土壤有机碳不仅是评价土壤肥力的至关因素，而且是全球碳循环的重要组成部分，对养分供给、土壤理化性质和结构改善和减少环境负面影响等具有重要作用［5］。土壤有机碳储量的小幅变化会影响整个生物圈生态系统的波动：土壤2 m 深，有机碳储量增加5%~15%大气碳库含量将降低16%~30%［6］。2015 年，巴黎气候会议上提出“增强陆地生态系统中土壤有机碳的固储能力可有效抑制大气中CO2浓度上升”。因此，近年来，土壤有机碳库的转化及分类的研究受到越来越多关注［7］。

Tiessen 等［8］根据土壤颗粒的大小不同，把土壤有机碳分为砂粒、粗粉砂粒、细粉砂粒、粗粘粒和细粘粒等5 类；Von L M 等［9］以密度为依据，将土壤分为轻组、重组有机碳；Chan 等根据土壤的化学特性将土壤分为活性碳和非活性碳；Patotn W J等［10］以Century 模型为依据，将土壤有机碳库分为易变碳库和稳定碳库。目前，大多研究人员以土壤的理化性质、微生物利用程度等为依据对土壤有机碳进行分类，并对土壤的固定、转化能力以及对农作物产量的影响进行研究［11］。很多研究人员都把土壤有机碳划分成活性有机碳、缓性有机碳和稳定性有机碳［12］。现阶段，国际上对土壤有机碳的分类趋于定量化、深层化以及国际化［13］。本文在前人对土壤有机碳研究基础上，综合土壤有机碳的分类与测定方法，从物理、化学、生物3个方面入手，旨在进一步认识土壤有机碳的特征，评价土壤质量，改善生态环境。

1 土壤有机碳的分类

1.1 土壤有机碳的物理分类

土壤有机碳的物理分类主要以有机碳相对密度、土壤颗粒大小或土壤团聚体等为依据。因原生质土壤状态在物理分类过程中被破坏度较低且性能保持良好，近年来，土壤有机碳的物理分组成为主流。物理分类主要通过崩解、分散、密度离心和沉降等方法来分离出活性不同的有机碳组分［14］。

1.1.1 密度分类

20 世纪80 年代就开始采用密度分类法，指采用某种相对密度的溶液将土壤中不同密度的颗粒有机物质分离开来的过程。其中，溶液中沉淀部分被定义为重组有机碳（Heavy fraction organic carbon，HFOC），悬浮部分物质被定义为轻组有机碳（Light fraction organic carbon，LFOC）。密度分离过程最常采用碘化钠（NaI）、聚钨酸钠（Na6H2W12O40）等水溶性分离溶液［15］。轻组有机碳库是介于植物残体和腐殖质类物质的碳库，主要以游离态存在。轻组有机碳是指能观察到真菌和放线菌孢子的微生物结构体，在土壤总量中的占比较小（1.8%~3.2%），但含碳量占土壤有机碳总量的15%~32%，大多来自植物碎片、植物根系及木炭，化学成分多为碳水化合物和氨基酸。重组有机碳主要成分为腐殖质，在土壤中以有机‐无机复合体形式存在，其含量一般占总有机质含量70%~80%。重组有机碳转化时间较长且对农业管理措施响应不灵敏，对其研究较少，也有学者发现，重组有机碳中有一种对气候、植被、施肥等外界环境非常敏感且易溶于盐溶液的有机质，暂命名为盐溶性有机碳［16］。

1.1.2 颗粒大小分类

由于土壤有机碳与土壤颗粒结合紧密，为了研究颗粒结合有机碳物理组分，将土壤中粒径在53~2 000 μm 的碳定义为颗粒有机碳（Particulate organic carbon，POC）［17］。土壤颗粒有机碳是动植物遗体向土壤腐殖质转化的过渡产物，可为微生物、植被生长提供必要的营养元素，一般情况下周期约为6~18 年。由于颗粒有机碳对外界条件变化的反应灵敏，因此土壤中的植物残留物质量、数量、土壤类型、气候条件以及耕作管理模式等都会影响颗粒有机碳的盈缺［18］。土壤有机碳可根据土壤颗粒粒径大小分为砂粒、粗粉砂粒、细粉砂粒、粗粘粒和细粘粒等。一般来说，砂粒占比10%，粗粉砂粒占比20%~25%，细粉砂粒占比16%~19%，粗粘粒占比35%，细粘粒占比17%~23%［19］。

1.1.3 团聚体分类

土壤团聚体是土壤结构的基本单元，对土壤有机碳起到保护作用，可阻碍微生物与底物相互接触，降低、抑制微生物活动，在土壤形成过程中扮演重要角色。土壤团聚体具有协调土壤水肥气热、影响土壤酶的种类和活性，保持土壤疏松熟化层“三大作用”［20］。土壤团聚体含有表层土90%左右的有机碳，对揭示人为干扰对碳循环的影响具有重要意义。土壤团聚体形成过程依赖有机胶结剂的作用，学者们根据形成团聚体胶结剂的不同，以250 μm 为界将团聚体分为大团聚体（Macroaggregates，A）和微团聚体（Microaggre‐gates，M），并规定粒径≥250 μm 的团聚体为大团聚体，粒径＜250 μm的团聚体为微团聚体。其中大团聚体可细分为＞5 000、2 000~5 000、250~2 000 μm，微团聚体可分为53~250、＜53 μm［21］。

1.2 土壤有机碳的化学分类

最初土壤有机碳化学分类以腐殖质类物质为主，目前土壤有机碳化学分组主要以碳组分在各种提取剂中的氧化性、溶解性和水解性不同进行分类，提取剂包括氧化剂、水或酸溶液等［22］。

1.2.1 根据物质组成分类

土壤腐殖质（Humic substances，HS）是土壤固相中呈棕色或黑色胶体状且性质较为活跃的物质，在土壤总质量中仅占一小部分，但在维持土壤肥力、保护生态环境、保障农业可持续发展等方面十分重要。主要表现3个方面：（1）土壤腐殖质是土壤中氮、磷的主要来源，与土壤形成、发育过程关系密切，对植物生长起到促进作用。（2）土壤腐殖质本身的吸附、络合作用能降低土壤重金属、有机化合物等对土壤的污染。（3）土壤腐殖质利用土壤的通透性、渗透性、吸附性和缓冲性等产生作用，改变土壤结构、胶体状况，起到调控水分运动的作用［23］。

土壤腐殖质根据物质组成细分为富里酸（Ful‐vic Acids，FA）、胡敏酸（Humic Acids，HA） 和胡敏素（Humin）3 类［24］。富里酸和胡敏酸是腐殖质的主要成分，统称为腐殖酸。胡敏酸是由具有芳香气味的芳香碳架和具有亲水集团的侧链碳两部分组成，其分子大小，芳构化程度和功能团的数量都会影响团聚体形成过程的速率。胡敏酸性质较为活泼，与富里酸的比值（HA/FA）可有效反映出土壤腐殖质的品质和稳定性，比值越高，说明腐殖质聚合程度越高，品质越好，稳定性越好，形成良好土壤结构的能力也越强。胡敏素与土壤矿物质结合最为紧密，主要以有机无机复合体形式存在，属于惰性腐殖质。土壤腐殖质的腐殖化过程缓慢，周期从几十年到上千年不等，且全球范围内的腐殖质结构、功能差异不明显，这些组分在土壤质量、作物产量和环境变化等的评价中存有滞后性，20世纪80年代后被逐渐取代［25］。

1.2.2 根据化学溶剂分类

根据土壤有机碳测定过程中使用的化学溶剂不同，将土壤有机碳划分成易氧化有机碳、溶解性有机碳和酸水解有机碳。

能被333 mmol/L KMnO4氧化的有机碳命名为易氧化有机碳（Readily oxidizable carbon，ROC）。易氧化有机碳在土壤有机碳中占比为13%~28%，为植物生长、土壤微生物活动提供能源，在土壤中易分解、易氧化、易矿化，其周转时间较短，参与的碳循环范围较大，能敏感反映群落植被与土壤环境早期的细微变化。测定过程中常用的氧化剂为K2Cr2O7和KMnO4［26］。

溶解性有机碳 （Dissolved organic carbon，DOC）是指能通过孔径为0.45 μm 滤膜、结构各异的有机分子统一体，主要成分为蛋白质、氨基酸、大分子腐殖质以及碳水化合物。植物凋落物、根系及其分泌物、土壤腐殖质以及微生物为溶解性有机碳提供碳源，溶解性有机碳性质活泼，易溶于水或稀盐溶液，其亲水部分对溶解性有机碳的溶解起到促进作用，含量随土壤深度的增加而减少；疏水部分为土壤微生物提供碳源，参与温室气体的排放［27］。溶解性有机碳作为陆地生态系统中较为活泼的有机碳组分，既能被矿质土壤吸附，也能随土壤水分的移动进入水体环境，成为土壤圈层连接其他圈层的重要物质形式。因此，对土壤DOC 在陆地碳循环中的研究也越来重视［28］。

酸水解是指利用硫酸和盐酸作为提取剂来提取土壤中的氨基酸、氨基糖以及碳水化合物等物质。提取过程中，硫酸可提取22%~45%有机碳，而盐酸可提取30%~87%有机碳。酸水解作用将酸水解有机碳分为活性有机碳和惰性有机碳，以此计算惰性指数、衡量惰性有机碳库大小。酸水解成分为多糖、核酸和蛋白质，未水解成分主要为木质素、脂肪、蜡、树脂和软木脂等，2%盐酸可水解半纤维素，80% 硫酸可水解结晶纤维素［29］。酸水解分组方法可预测有机碳的矿化，比热水提取有机碳应用广，稀释酸水解提取的糖类是热水提取糖类的5~16 倍，约占土壤总糖类的65%~85%。酸水解产物中的碳水化合物，虽然含量仅占总有机碳的10%~20%，却是微生物的主要碳源和能源。活性有机碳作为土壤有机碳和土壤性质研究中的重要指标和对象，参与土壤团聚体的形成。酸水解作用是通过去除参与微团聚化的多价阳离子，使闭蓄态或复合体中的有机碳溶解，与盐酸相比，用硫酸水解有机碳组分更易受矿质的影响［30］。

1.3 土壤有机碳的生物分类

土壤有机碳的生物分类是用特定的生物方法将土壤有机碳分为生物潜在可矿化碳（Potentially mineralizable carbon，PMC））、微生物生物量碳（Soil microbial biomass carbon，SMBC）。微生物生物量碳指土壤中小于5~105 μm3的活细菌、真菌、藻类和土壤微生物体内所含的碳，是土壤中最活跃的一部分有机碳［31］。微生物生物量碳在土壤中占比较少，直接参与土壤代谢与分解，是土壤中至关重要的部分。把微生物生物量碳与土壤有机碳的比值来衡量土壤碳的平衡、积累或消耗，即为评价土壤有机碳动态变化的指标。目前可测定土壤微生物生物量碳的方法很多，例、如直接镜检法、三磷酸腺苷分析法、熏蒸培养法，熏蒸提取法，底物诱导呼吸法和磷脂脂肪酸法等，其中最常用的则是氯仿熏蒸法［32］。生物潜在可矿化碳的测定需要采用微生物学方法，即微生物分解有机物质过程中每单位微生物量产生的CO2量。高值代表发酵微生物区系的活性，低值则反映稳态土著性微生物区系的活性，该指标同时是评价土壤肥力的重要尺度之一，在整个碳循环过程中起着至关重要的作用［33］。

2 土壤有机碳的测定方法

随着对全球碳汇和碳循环的深入研究，土壤有机碳的测定方法也越来越多样化、精准化。根据土壤有机碳分类方法可将土壤有机碳的测定方法分成3类：第一类以土壤有机碳的密度、颗粒大小、团聚体大小为依据；第二类以土壤有机碳的物质组成、分类溶剂、稳定性为依据；第三类以土壤有机碳的生物活性为依据［34］。

2.1 土壤有机碳的物理测定方法

2.1.1 密度分组技术

密度分组技术以土壤在一定比重溶液中的沉降程度不同为原理，将土壤有机碳分为轻组有机碳和重组有机碳［35］。比重溶液多选择碘化钠、溴化钾、硫酸镁和聚钨酸钠等，其中最常用的则是碘化钠溶液。测定方法：采集回来的土壤进行风干处理，然后过2 mm 筛，称取土样10 g 于50 mL离心管中，加入20 mL NaI 溶液 （密度 1.8 g·cm‐3）震荡，确保土壤与溶液混合均匀，随后加入10 mL蒸馏水清洗离心管内壁，混合液静置一段时间，在离心机转速为5 000 r/min下离心10 min，将离心管中的上清液过0.45 μm滤膜，并用蒸馏水冲洗至滤液无色为止，最后将滤膜部分和离心管剩余部分物质分别转移到铝盒中烘干，其中，滤膜部分为轻组有机碳，离心管部分为重组有机碳［36］。

2.1.2 土壤颗粒分级技术

土壤颗粒分级以土壤粒径大小为依据进行划分。土壤风干处理后，称取10 g 倒入250 mL 烧杯中，随后加入100 mL 水震荡，震荡均匀后在超声波发生器上处理30 min，将溶液过53 μm筛，得到粒径53~2 000 μm 砂粒组分，根据离心时间和离心速度不同进而可以分离出粒径为5~53 μm 的粗粉砂粒，2~5 μm 的细粉砂粒，0.2~2 μm 的粗粘粒，＜0.2 μm为细粘粒［37］。

2.1.3 筛分法测定团聚体

筛分法包括湿筛法和干筛法2种，由于干筛法分离结果重复性差，因此，常采用湿筛法测定团聚体。即称取风干土样100 g 于土壤团粒分析仪上，用5 mL 超纯水浸润8 h，再通过2 000、250、53 μm 筛子，筛分时振幅 3 cm，频率 50 次/min，全程在纯水中进行，分离出粒径＞2 000 μm、250 ~2 000 μm、53~250 μm、＜53 μm4类团聚体，其中，粒径 ＞ 250 μm 称为大团聚体，＜250 μm 称为微团聚体［38］。

2.2 土壤有机碳的化学测定方法

2.2.1 腐殖质分组技术

土壤腐殖质提取分离方法如图1，称取2.5 g土样倒入100 mL 的离心管，随后加入50 mL 0.1 mol/LNaOH 与 0.1 mol/L Na4P2O7混合液混匀，浸提一段时间后连续震荡5 min，在沸水浴中煮1 h，放入离心机中离心，离心上清液置于50 mL 试管中，所剩难溶性残渣为胡敏素。再用0.5 mol/L H2SO4作为酸化剂分离出胡敏酸与富里酸，其中，富里酸一般采用疏水树脂｛XAD‐8｝纯化［39］。

图1 土壤腐殖质提取分离流程图

2.2.2 化学溶剂分组技术

溶解性有机碳测定方法：称取10 g 风干土样于100 mL 三角瓶中，加入盐溶液浸提（土液比1：5）30 min，离心机离心（5 000 r/min）15 min，上清液用0.45 μm 滤膜抽滤，滤液在TOC 分析仪上测定，通过土液比将溶解性有机碳浓度（mg/L）值换算成土壤溶解性有机碳含量（mg/kg），常用的提取剂盐溶液有CaCl2、KCl、K2SO4［40］。

易氧化有机碳测定方法：称取0.5 g 细土倒入50 mL离心管中，同时设置空白对照（离心管内不加土样，其余操作一致）；加入25 mL333 mmol/L KMnO4溶液，室温下震荡30 min 后，在离心机中离心（5 000 r/min）5 min；离心上清液按照1∶250比例用蒸馏水稀释，在分光光度计565 nm 测定稀释样品的吸光值。根据加土样和未加土样样品的吸光值之差，计算出KMnO4的浓度变化，氧化过程中KMnO4浓度每变化1 mmol/L 相当于氧化 9 mg 碳［41］。

酸水解有机碳的测定用硫酸做提取剂：准确称取1.00 g 土样于消煮管中，随后加入20 mL 2.5 mol/LH2SO4于105 ℃下消煮20 min，消煮结束，放置室温后用离心机离心（5000 r/min）20min，第一次离心完倒出上清液，二次离心，两次上清液均在0.45 μm滤膜下过滤，测得酸水解产物为土壤有机碳活性组分I；离心管中的残留物烘干后加入26 mL1 mol/LH2SO4油浴3 h（105 ℃）后重复上述离心操作，测得酸水解产物为土壤有机碳活性组分Ⅱ［42］。另一种用盐酸作为提取剂：称取2 g 土样于消煮管中，加入6 mol/LHCl 消煮16 h（115 ℃），样品冷却室温后烘干至恒重，测得的碳含量即为惰性有机碳，总有机碳量减去惰性有机碳即为酸水解有机碳［43］。

2.3 土壤有机碳的生物测定方法

微生物生物量碳的测定目前有氯仿熏蒸培养法、氯仿熏蒸浸提法、基质诱导呼吸法等，由于微生物的多样性，测定方法也不尽不同，应用最多的是氯仿熏蒸浸提法［44］。即称取过2 mm 筛土样25 g 于100 mL 烧杯中，放入干燥皿，同时放入装有50 mLNaOH溶液和50 mL氯仿的烧杯一同干燥，干燥皿底部加入少量水保持湿度，干燥皿密封好，通过顶部活塞抽出内部空气，直至干燥皿中的氯仿沸腾3 min，随后关上活塞并且密闭干燥皿，将干燥皿放在避光处熏蒸24 h，熏蒸结束后放出干燥皿中氯仿，再用真空泵反复抽气，直至干燥皿中没有氯仿气味。熏蒸结束后，把所有样品小心转移至250 mL 三角瓶中，随后加入100 mL 0.5mol/L K2SO4溶液震荡浸提30 min，浸提结束后过滤浸提液，滤液放于塑料瓶中储存。同时做对照，即把未进行熏蒸的土壤也用同浓度的K2SO4溶液震荡、浸提、过滤。K2SO4浸提液应立即用TOC分析仪测定或放在4 ℃冰箱中保存，通过比较熏蒸与未熏蒸土样浸提液中含碳量的差异，计算出微生物生物量［45］。

目前，土壤有机碳矿化速率变化主要通过测定土壤潜在的碳矿化，了解干扰对土壤碳矿化速率的影响，即通过每单位微生物量产生的CO2量来测定，这也是国际上通用的短期土壤培养法：取适量的土壤样品于密闭容器中，同时放入一杯NaOH 溶液用于吸收CO2，保持容器内的持水量培养一段时间后，用HCl溶液滴定NaOH 溶液，即可用实验过程消耗的盐酸量求得土壤可降解量。且在培养可降解碳过程中，要保证土壤样品所处的环境温度、湿度适宜，密闭性良好［46］。

3 展望

土壤有机碳尤其是活性较高的有机碳，对有机物质分解、矿化速率、养分循环以及土壤结构的生物物理控制有重要作用，成为陆地生态系统中研究的热点，也是全球变化问题研究的核心内容之一。纵观国内外学者对土壤碳库组分的研究可以看出：

（1）土壤有机碳测定过程中，由于实验环境、研究目的以及测定方法的不同，造成实验结果差异。比如氯仿熏蒸法测定土壤微生物量碳时存在的缺陷：有效性指标易受外界环境的影响；生物潜在可矿化碳无直接测定方法，间接测定过程误差较大；分离重组、轻组有机碳的研究较少，至今未找到分离过程中相对理想的密度分离液；颗粒有机碳分组依据、样品处理等问题还没有较为明确的统一。

（2）对土壤有机碳的研究不够全面。活性有机碳、总有机碳的研究较多，但全面研究各类碳及其转换关系的较少。土壤碳存在着极其复杂的转化过程，仅从一种碳变化分析土壤‐大气碳循环机理是不够深入的。需要在此基础上对土壤中各类碳的变化及相关关系进行全面深入研究，这对实现土壤固碳、节能、减排，提高土壤肥力，改善生态环境具有重要意义。

（3）近年来，学者们主要根据土壤有机碳的有效性、特性、分离提取方法来命名、划分，对土壤有机碳测定方法由最初的剧烈提取手段（化学分组技术）发展到轻微提取手段（物理分组技术）再发展到几乎保持土壤微生物活性手段（生物方法）。因此，在土壤有机碳测定过程中应更加规范使用先进的仪器、设备，如红外光谱核磁共振和同位素示踪等；在土壤有机碳分组问题上应明确各类碳组分概念和联系；在土壤有机碳的测定方法上应更加统一，使其整个有机碳研究更加规范化、系统化。

土壤碳库构成特征直接影响土壤碳库变化，充分了解土壤碳库构成对土地利用的响应，增强土地的合理利用程度，从而实现土地的可持续发展。土壤有机碳的不同分类系统对理解有机物质分解、矿化、养分循环变化以及土壤结构的改善有重要作用，成为陆地生态系统中碳循环的热点问题。