石墨烯量子点荧光探针对碱性磷酸酶活性的高效检测

黄 珊，姚建东，宁 淦，肖 琦，刘 义，2

（1.南宁师范大学化学与材料学院,广西天然高分子化学与物理重点实验室,南宁 530001；2.天津工业大学化学与化工学院,天津 300387）

石墨烯量子点（GQDs）是一种具有石墨烯结构的新型荧光纳米材料［1］.与传统的半导体量子点相比，GQDs具有抗光漂白性强、细胞毒性低、生物相容性好和荧光性能优良等优势［2，3］，在生物传感、生物成像和光电器件等领域具有广阔的应用前景［4，5］.GQDs荧光探针因其独特的荧光性能，被广泛用于多种蛋白酶的活性检测，如酪氨酸酶［6］、胰蛋白酶［7，8］、乙酰胆碱酯酶［9］、酸性磷酸酶［10］及碱性磷酸酶（ALP）［11，12］等.

ALP是一种具有磷酸底物特异性的水解酶，可以催化碱性介质中多种含磷化合物的水解或去磷酸化.血清ALP水平紊乱已被证明可导致多种严重疾病，如动态骨病、前列腺癌、乳腺癌、肝功能障碍和糖尿病等［13］.因此，ALP常被作为重要的生物标志物用于多种疾病的临床诊断［14］.在生物学分析中，ALP可用作反应中的酶标记或指示剂，以量化免疫测定和基因测试或其它方法的组合过程［15］.为了更好地了解ALP在临床实践和相关生物学过程中的作用，迫切需要开发灵敏、简单且可靠的ALP活性检测方法.目前，ALP活性的检测方法主要包括比色法［15］、荧光分析法［11，13］、电化学分析法［16，17］和表面增强拉曼散射法［18］等.其中，荧光分析法因其快速、简单和灵敏的信号转导能力而具有较大的检测优势.铜-邻二氮菲配合物［19］、聚多巴胺纳米粒子［20，21］、钴氢氧化物-铜纳米团簇［22］、银纳米团簇［23］、金纳米粒子［24］、二硫化钼量子点［25］和碳量子点［26］等荧光探针被广泛用于ALP活性的检测.然而，常见荧光染料的荧光稳定性较差，荧光纳米材料又存在合成条件苛刻、成本高等不足，限制了这些荧光探针的进一步实际应用.因此，寻找合适的荧光探针来有效检测ALP活性仍具有一定的挑战.

本文基于苯醌类物质能静态猝灭GQDs荧光的特性，建立了一种利用GQDs荧光探针高效检测ALP活性的新方法.如Scheme 1所示，过氧化氢（H2O2）在辣根过氧化物酶（HRP）催化作用下产生·OH，强氧化性的·OH能将邻苯二酚（o-DHB）氧化成邻苯醌（o-benzoquinone）并猝灭GQDs的荧光［3］.抗坏血酸-2-磷酸（AAP）能被ALP催化降解生成抗坏血酸（AA），具有强还原性的AA可有效清除溶液中的H2O2和·OH［3］，进而抑制邻苯醌的生成，诱使GQDs的荧光恢复.随着ALP活性的增大，在440 nm处的荧光不断增强，由此建立了一种ALP的高灵敏检测方法.该方法可用于人血清中ALP活性的检测，为与ALP相关的疾病诊断与治疗提供了理论基础.

Scheme 1 Proposed mechanism for ALP activity evaluation by GQDs

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

GQDs（1 mg/mL）购于南京先丰纳米材料科技有限公司；o-DHB，o-benzoquinone和N-乙基马来酰亚胺（NEM）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；ALP，AAP，AA，HRP，H2O2，Na3VO4，蛋白质、氨基酸和金属离子购自美国Sigma-Aldrich有限公司；以上试剂均为分析纯，使用时未经进一步纯化；实验用水均由美国Millipore-Q公司超纯水系统纯化制得（18.2 MΩ·cm）.

JEM-2011型场发射透射电子显微镜（TEM，日本JEOL公司）；Nicolet iS10型傅里叶变换红外光谱仪（FTIR，美国Thermo Fisher Scientific公司）；ZF-20D型暗箱式紫外分析仪（上海宝山顾村电光仪器厂）；UV-3600 Plus型紫外-可见分光光度计（UV-Vis）和RF-6000型荧光分光光度计（日本岛津公司）；QM-8075型稳态瞬态荧光光谱仪（日本堀场公司）；PB-21型pH计（赛多利斯科学仪器有限公司）．

1.2 GQDs的表征

1.2.1 透射电子显微镜表征 将用超纯水溶解的GQDs超声10 min后，取10μL滴加在铜网超薄碳支持膜上，用红外灯干燥后进行透射电子显微镜（TEM）测试.测试时电子的加速电压为200 kV.

1.2.2 傅里叶变换红外光谱分析 将固体GQDs研磨后采用KBr压片法进行红外光谱测试，扫描范围4000～400 cm-1.

1.2.3 荧光光谱分析 发射光谱的测定：采用浓度为25μg/mL的GQDs溶液，设定激发波长为380 nm，激发狭缝和发射狭缝均为5 nm，发射光谱测量范围为390～650 nm.激发光谱的测定：采用浓度为25μg/mL的GQDs溶液，设定发射波长为440 nm，激发狭缝和发射狭缝均为5 nm，激发光谱测量范围为325～425 nm.

1.2.4 绝对荧光量子产率测定 设定激发波长为380 nm，发射光谱范围为390～600 nm进行测试.绝对荧光量子产率（QY，%）按照下式计算［27］：

式中：Lemission代表GQDs的发射光子数；Esolvent和Esample分别表示溶剂和GQDs的激发光子数.

1.2.5 荧光寿命测定 利用激发光波长为340 nm的脉冲光源，测定GQDs的荧光衰变曲线.GQDs的平均荧光寿命（＜τ＞，ns）按照以下公式采用双指数拟合方式计算［28］：

式中：τi（ns）为GQDs的荧光衰减时间；bi为归一化的指数前因子.

1.3 H2O2和AA的检测

1.3.1 H2O2的检测 将200μL不同浓度的H2O2，50μL HRP（0.8μg/mL），50μLo-DHB（6 mmol/L）和600μL Tris-HCl缓冲溶液（50 mmol/L，pH=6.0）混合均匀，于25°C反应30 min；然后将100μL GQDs（250μg/mL）加入混合溶液中，室温下继续反应1 min.

1.3.2 AA的检测 首先制备100 mmol/L的AA新鲜储备溶液，制备后不超过4 h内使用，以最大程度地减少空气中的氧化.将200μL不同浓度的AA，200μL H2O2（500μmol/L），50μL HRP（0.8μg/mL），50μLo-DHB（6 mmol/L）和400μL Tris-HCl缓冲溶液（50 mmol/L，pH=6.0）混合，于25°C反应30 min；然后加入100μL GQD（250μg/mL），室温下继续反应1 min.在380 nm激发波长下测定溶液的荧光光谱，记录GQDs在440 nm处的荧光强度用于定量分析.

1.4 ALP活性检测

将100μL不同活性的ALP（pH=8.0）和50μL AAP（10 mmol/L）混合，在37°C水浴中反应20 min；然后将200μL H2O2（500μmol/L），50μL HRP（0.8μg/mL），50μLo-DHB（6 mmol/L）和450μL Tris-HCl缓冲溶液（50 mmol/L，pH=6.0）混合，在25°C下反应20 min；然后将100μL的GQDs（250μg/mL）加入混合溶液中，室温下继续反应1 min.在380 nm激发波长下测定溶液的荧光光谱，记录GQDs在440 nm处的荧光强度用于定量分析.

1.5 人血样中ALP活性检测

通过静脉穿刺法获得课题组中健康成年男性和女性志愿者的人体血液样品，以10000 r/min转速离心8 min后取上层清液，于-20°C储存.将离心后的人血清样品用Tris-HCl缓冲溶液（50 mmol/L，pH=8.0）稀释10倍，加入0.3 mmol/L的NEM以消除实际样品中谷胱甘肽和半胱氨酸的干扰［29］.将100μL不同浓度的预处理人血清样品代替ALP标准溶液加入检测体系中，其余测试步骤和条件与ALP的活性检测相同.记录GQDs在440 nm处的荧光强度用于检测人血清样品中ALP的活性.

2 结果与讨论

2.1 GQDs的表征

如图1（A）中TEM照片所示，GQDs粒子呈近似球状，颗粒分散性较好，无明显聚集现象.图1（A）插图中单个GQDs粒子的HRTEM照片清晰地显示了GQDs的晶体结构，晶格间距为0.24 nm，归属于石墨（sp2）碳的（001）衍射晶面［30］.对GQDs的粒径进行了统计分析，如图1（B）所示，GQDs的粒径分布较窄且呈正态分布，粒径主要分布在2.5～3.5 nm之间，平均粒径为2.99 nm.

Fig.1 TEMimage(A)and size distribution(B)of GQDsInset of(A)is HRTEM image of one GQDs particle.

由GQDs的FTIR表征结果（图2）可知，3431 cm-1处的吸收峰归属于O—H键的伸缩振动［31，32］；2912和1383 cm-1的吸收峰分别归属于C—H键的伸缩振动和弯曲振动［33］；1634和871 cm-1处的2个特征吸收峰分别归属于C=O键的伸缩振动和N—H键的弯曲 振 动［31，33］.FTIR结 果 表 明，GQDs表 面 富 含—COOH和—OH等含氧官能团，致使GQDs具有良好的水溶性.

Fig.2 FTIR spectrum of GQDs

如图3（A）中紫外-可见吸收光谱所示，GQDs在372 nm处的典型吸收峰对应于C=O键的n→π*电子跃迁［34］.由荧光光谱可知，GQDs的荧光激发峰与发射峰呈现狭窄而对称的特点，证明GQDs的粒径大小均匀、分散性好.由图3（A）中插图可见，GQDs溶液在自然光下呈无色透明，但在365 nm紫外灯照射下呈现明亮的蓝色荧光.采用积分球计算得到GQDs的绝对荧光量子产率为14.2%.通过双指数方程拟合得知GQDs的平均荧光寿命为（3.12±0.11）ns.

Fig.3 UV-Vis absorption and fluorescence spectra of GQDs(A)and emission spectra of GQDs under different excitation wavelengths(B)Insets in（A）are photographs of GQDs under the irradiation of white light（left）and 365 nm UV lamp（right）.

由图3（B）可知，当GQDs的激发波长从320 nm增大到410 nm时，GQDs的荧光发射波长基本维持在440 nm不变，只是最大荧光发射强度先增大再减小.由此可知，GQDs的最佳激发波长和最佳荧光发射波长分别为380 nm和440 nm.与大多数碳基荧光纳米材料的激发波长依赖性特征不同，恒定的荧光发射波长表明GQDs只含有一个发射体，可有效避免自发荧光影响，提高其分析检测的抗干扰能力和分辨率.

在实际检测过程中，GQDs荧光探针的荧光性能受荧光持久度、离子强度和溶液pH影响较大.如图4（A）所示，当GQDs在365 nm紫外灯下连续照射180 min后，GQDs的荧光强度几乎维持不变，表明GQDs具有较强的抗光漂白性和较好的荧光持久度.如图4（B）所示，将NaCl的浓度从0调节到3 mol/L时，GQDs的荧光强度依然不变，表明GQDs在高离子浓度下能保持较好的荧光稳定性.如图4（C）所示，GQDs在pH=4.0～8.5范围内能保持较好的稳定性.以上结果表明，GQDs在苛刻的条件下也具有优异的光学稳定性，是一种很有前途的荧光纳米传感材料.

Fig.4 Effects of irradiation time(A),NaCl concentration(B)and pH value(C)on the fluorescence intensity of GQDs

2.2 检测机制研究

Fig.5 Fluorescence spectra of GQDs(a),GQDs/HRP(b),GQDs/o-DHB(c),GQDs/H2O2(d),GQDs/AAP(e),GQDs/ALP(f),GQDs/AA(g),GQDs/Na3VO4(h),GQDs/HRP/o-DHB(i),GQDs/HRP/H2O2/o-DHB(j),GQDs/AAP/HRP/H2O2/o-DHB(k),GQDs/ALP/AAP/HRP/H2O2/o-DHB(l)and GQDs/Na3VO4/ALP/AAP/HRP/H2O2/o-DHB(m)

由图5可知，单独的HRP，o-DHB，H2O2，AAP，ALP，AA和Na3VO4对GQDs的荧光强度几乎无影响（图5中谱线b～h）.当HRP和o-DHB共存时，无法生成o-benzoquinone，所以GQDs的荧光强度维持不变（图5中曲线i）.当HRP，H2O2和o-DHB共存时，会生成o-benzoquinone，致使GQDs在440 nm处的荧光被猝灭（图5谱线j）.继续加入AAP后，这种情况保持不变（图5谱线k）.当ALP，AAP，HRP，H2O2和o-DHB共存时，生成的还原剂AA能有效清除溶液中的H2O2和·OH，抑制o-benzoquinone的生成，使GQDs的荧光强度维持在其原始值附近（图5谱线l）.当加入ALP的抑制剂Na3VO4时，GQDs的荧光再次被猝灭（图5谱线m），验证了Na3VO4对ALP活性的抑制作用.由此可知，该GQDs荧光探针可同时用于ALP的活性检测及其抑制剂的检测.

为了揭示该检测方法的猝灭机制，考察了单独GQDs，H2O2/HRP/o-DHB体系和GQDs/H2O2/HRP/o-DHB体系的紫外-可见吸收光谱，以及GQDs/H2O2/HRP/o-DHB体系和单独GQDs的紫外-可见吸收差谱.如图6（A）所示，H2O2/HRP/o-DHB体系的吸收光谱与（GQDs/H2O2/HRP/o-DHB）-GQDs的吸收差谱无重叠，表明由H2O2/HRP/o-DHB体系生成的o-benzoquinone与GQDs形成了新的基态复合物［11，12］，初步证明了o-benzoquinone静态猝灭GQDs荧光的作用机制.为进一步验证这一作用机制，考察了H2O2/HRP/o-DHB体系对GQDs荧光寿命的影响.如图6（B）所示，单独GQDs的平均荧光寿命为（3.12±0.11）ns，而GQDs/H2O2/HRP/o-DHB体系的平均荧光寿命为（3.11±0.08）ns，GQDs的荧光寿命几乎无变化，表明由H2O2/HRP/o-DHB体系生成的o-benzoquinone对GQDs的荧光寿命无影响，验证了o-benzoquinone静态猝灭GQDs荧光的作用机制［11，12］.

Fig.6 UV-Vis absorption spectra of GQDs,H2O2/HRP/o-DHB,GQDs/H2O2/HRP/o-DHB and(GQDs/H2O2/HRP/o-DHB)-GQDs systems(A),fluorescence decay traces of GQDs and GQDs/H2O2/HRP/o-DHB system(B)Insets in（B）are fluorescence lifetimes data of GQDs(a)and GQDs in GQDs/H2O2/HRP/o-DHB system(b).τis the fluorescent lifetime of trypsin and b is the normalized pre-exponential factor.The average fluorescence lifetime(＜τ＞)is calculated according to the equation of＜τ＞=τibi.

2.3 H2O2和AA的检测

GQDs荧光探针可用于H2O2和AA的检测.为达到最佳检测效果，对相关检测条件进行了优化.如图7所示，在以下实验条件下，GQDs的相对荧光强度信号I/I0（I0和I分别表示加入物质前后GQDs在440 nm处的荧光强度值）达到最优值：GQDs的浓度为250μg/mL（100μL）［图7（A）］；HRP的浓度为0.8μg/mL（50μL）［图7（B）］；o-DHB的浓度为6 mmol/L（50μL）［图（C）］；Tris-HCl缓冲液的pH值为6.0［图7（D）］；反应温度为25℃［图7（E）］；反应时间为40 min［图7（F）］.

Fig.7 Effects of GQDs amount(A),HRP amount(B),o-DHB concentration(C),pH value(D),reaction temperature(E)and reaction time(F)on the relative fluorescence intensity of GQDs-based fluorescent probe

由图8（A）可知，当H2O2浓度逐渐增大时，GQDs荧光探针检测体系在440 nm处的荧光强度不断减弱.如图8（B）所示，当H2O2浓度从0增加到200μmol/L时，GQDs荧光探针检测体系的I/I0值不断减弱.在最优条件下，当H2O2的浓度在0.4～100μmol/L范围内时，I/I0值与H2O2浓度呈良好的线性关系，线性回归方程为I/I0=-0.0078×［H2O2］+0.971，相关系数为0.996.由公式LOD=3σ/s（其中，s为标准曲线的斜率，σ为11次空白测试得到的标准偏差）计算得出H2O2的检出限为0.318μmol/L.

Fig.8 Fluorescence spectra of GQDs-based fluorescent probe with increasing concentration of H2O2(A)and relationship between relative fluorescence intensity ratio I/I0 and concentration of H2O2(B)Inset of（B）is the linear relationship between the relative fluorescence intensity ratio I/I0 and concentration of H2O2 from 0.4μmol/L to 100μmol/L.

由图9（A）可知，当AA的浓度逐渐增大时，GQDs荧光探针检测体系在440 nm处的荧光强度不断增强.如图9（B）所示，当AA浓度从0增加到160μmol/L时，GQDs荧光探针检测体系的I/I0值不断增强.在最优条件下，当AA的浓度在1～40μmol/L范围内时，I/I0值与AA浓度呈良好的线性关系，线性回归方程为I/I0=0.0486×［AA］+1.01，相关系数为0.998.由公式LOD=3σ/s计算得出AA的检出限为0.588μmol/L.

Fig.9 Fluorescence spectra of GQDs-based fluorescent probe with increasing concentration of AA(A)and relationship between relative fluorescence intensity ratio(I/I0)and concentration of AA(B)Inset of（B）is the linear relationship between the relative fluorescence intensity ratio（I/I0）and concentration of AA from 1.0μmol/L to 40μmol/L.

2.4 ALP的活性检测

合成的GQDs荧光探针可进行ALP活性的实时、高效检测，实验中探索了最佳检测条件.如图10所示，在以下实验条件下，GQDs荧光探针检测体系的相对荧光强度信号I/I0达到最优值：Tris-HCl缓冲溶液的pH为8.0［图10（A）］；酶反应温度为37℃［图10（B）］；酶反应时间为20 min［图10（C）］.

Fig.10 Effects of pH value(A),enzymatic reaction temperature(B)and enzymatic reaction time(C)on the relative fluorescence intensity of GQDs-based fluorescent probe

由图11（A）可知，当ALP的活性逐渐增大时，GQDs荧光探针检测体系在440 nm处的荧光强度不断增强.如图11（B）所示，当ALP的活性从0逐渐增加到15 U/L时，GQDs荧光探针检测体系的I/I0不断增强.在最优条件下，当ALP的活性在0.1～5 U/L范围内时，I/I0值与ALP活性呈良好的线性关系，并且符合线性回归方程I/I0=0.434×［ALP］+1.04，相关系数为0.998.由公式LOD=3σ/s计算得出ALP的检出限为0.084 U/L.

Fig.11 Fluorescence spectra of GQDs-based fluorescent probe with increasing activity of ALP(A)and relationship between relative fluorescence intensity ratio(I/I0)and activity of ALP(B)Inset of（B）is the linear relationship between the relative fluorescence intensity ratio（I/I0）and activity of ALP from 0.1 to 5 U/L.

在最佳检测条件下，考察了该GQDs荧光探针检测体系对ALP活性检测的选择性.如图12所示，当加入10倍于ALP活性的蛋白质时［胃蛋白酶（Pep）、胰蛋白酶（TRY）、溶菌酶（Lys）、凝血酶（Thr）、人血清白蛋白（HSA）、牛血清白蛋白（BSA）、葡萄糖氧化酶（GOx）和乙酰胆碱酯酶（AchE）］，这些蛋白质均不会影响GQDs荧光探针检测体系的I/I0值.由此可知，该方法对ALP的活性检测具有较好的选择性.

Fig.12 Effects of different enzymes on the relative fluorescence intensity of GQDsbased fluorescent probea.ALP;b.blank;c.Pep;d.TRY;e.Lys;f.Thr;g.HSA;h.BSA;i.GOx;j.AchE.

在最佳检测条件下，考察该GQDs荧光探针检测体系对ALP活性检测的抗干扰能力.如表1所示，常见的共存物质，如生物小分子、氨基酸和金属离子等，对GQDs荧光探针检测体系荧光几乎无影响.因此，该GQDs荧光探针检测体系对ALP活性的检测具有较强的抗干扰能力，有望用于实际样品中ALP活性的高效检测.

据报道，成人血清样品中ALP的活性通常为40～190 U/L［14］.根据上述所得ALP活性检测的线性拟合回归方程，可计算出原始人血清样品中ALP的活性.如表2所示，在乘以稀释因子后，用该GQDs荧光探针测得人血清中的ALP活性在87.2～145 U/L范围内，此结果符合报道值［14］.当将3种不同活性的ALP（0.5，3和5 U/L）加入到溶液中时，人血清样品中ALP活性测定的回收率在95.5%～103.7%范围内，相对标准偏差为0.02%～4.09%.结果表明，该GQDs荧光检测体系能达到ALP活性检测的要求，为实际生物样品中ALP活性的实时、准确检测提供了可能.

Table 1 Influences of 0.1 mmol/L co-existing substances on ALP activity evaluation

Table 2 Evaluation of ALP activity in human serum samples

如表3所示，与一些已报道的ALP活性检测的方法相比，本文构建的GQDs荧光探针检测体系对ALP活性的检测具有原材料成本低、操作简便及检出限低等优势.

Table 3 Evaluation of ALP activity with different methods and different probes

3 结 论

基于苯醌类物质能静态猝灭GQDs荧光的特性，建立了基于GQDs的荧光探针检测体系，用于ALP活性的实时、高效检测.该方法对ALP活性的检出限为0.084 U/L，具有良好的选择性和较强的抗干扰能力，并可被用于人血清样品中ALP活性的检测.此方法在与碱性磷酸酶相关的疾病诊断与治疗方面具有广阔的应用前景.